产抗氧化活性物质的海洋放线菌筛选与鉴定

秦曼曼,张雪梅,王晓杰,冯紫君,刘　颖,千忠吉,王雅玲

(广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088)



产抗氧化活性物质的海洋放线菌筛选与鉴定

秦曼曼,张雪梅,王晓杰,冯紫君,刘颖*,千忠吉,王雅玲

(广东海洋大学食品科技学院,广东湛江 524088)

采用传统的分离培养技术对4种海洋动物肠道中的放线菌进行分离,利用紫外-可见分光光度法对分离菌株的代谢产物进行抗氧化活性初筛测定,再采用电子自旋共振仪(ESR)进行4种自由基清除率复筛测定,并对抗氧化活性强的菌株进行16S rDNA水平鉴定与系统发育树分析。结果表明共分离到37株放线菌,初筛测定获得7株菌的代谢产物对DPPH自由基清除率超过50%,其中菌株CH16与CH38的代谢产物通过ESR测定发现对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基及烷基自由基的消除率均超过50%,并分别鉴定为Amycolatopsisrifamycinica与Amycolatopsissp.。该研究为从海洋环境获得产生抗氧化活性物质菌株资源与开发提供依据。

抗氧化活性,代谢产物,海洋放线菌,筛选,鉴定

具有高度化学生物活性的自由基是生物体新陈代谢活动中重要的中间代谢产物[1],若体内不能维持在适当的水平,将会导致生物体氧化损伤,最终诱发动脉粥样硬化、糖尿病、高血压、机体老化,甚至癌症等疾病[2-3]。而抗氧化剂可以消除氧化带来的不良影响,帮助捕获和中和自由基,从而消除自由基对机体的伤害。抗氧化剂既可以是机体产生的,也可以从食物中摄取,尤其抗氧化性较强的抗氧化剂通常需要外界提供。目前,来自植物中的多酚类、黄酮类等物质具有明显的自由基清除活性和抗氧化作用[4-5],但是这些植物资源存在生长周期长,生产成本高的缺陷。因此,寻求新的来源抗氧化剂物质受到广泛的关注,而最近的研究显示海洋源放线菌是天然抗氧化剂一个重要的来源[3,6],尤其是生活在极端温度、pH、盐度及静水压力等环境中的微生物,这些微生物在长期的进化过程中形成了特殊的防御机制或特殊的化合物来抵抗氧化应激带来的机体损伤[6-7]。

本研究从4种海洋动物肠道中分离纯化放线菌,通过DPPH自由基消除率、羟自由基消除率、超氧阴离子消除率和烷基自由基消除率实验,筛选产抗氧化活性物质的海洋放线菌,并对代谢产物抗氧化活性强的菌株进行16S rDNA基因水平的鉴定,研究为从海洋环境获得具有抗氧化活性菌株的筛选与开发提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

从湛江水产品市场中购买的军曹鱼(Rachycentroncanadum)、龙头鱼(Harpadonnehereus)、青鳞鱼(Harengulazunasi)和翡翠贻贝(Pernaviridis)用密封袋封好,并将其放在随身携带的便携式冰箱(2～8 ℃)中运回实验室。

高氏Ⅰ号培养基g/1000 mL:(可溶性淀粉 10.0,NaCl:0.5,KNO3:1.0,K2HPO4:0.5,FeSO4:0.01,琼脂:20.0,重铬酸钾:0.01,pH:7.2～7.4);1,1-二苯基-2一三硝基苯肼(DPPH)、水杨酸、5,5 - 二甲基吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、2,2′-偶氮(2-脒基丙烷)-二盐酸盐(AAPH)、α-(4-吡啶基-1-氧)-氮-叔丁基硝酮(POBN)、H2O2(3%)、七水合硫酸铁溶液、Tris、KNO3Sigma公司;MightyAmp DNA Polymerase Ver.2试剂盒宝生物工程(大连)有限公司产品。

Spx-250B生化培养箱上海跃进医疗器械厂;LS-B50L立式压力蒸汽灭菌锅、SW-CJ-2F洁净工作台上海博迅实业有限公司医疗设备厂;YS100双目电光生物显微镜日本尼康公司;5810R台式高速冷冻离心机 德国eppendorf公司;HH.B11-600-BS-Ⅱ电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂;XW-80A涡旋混合器上海精科实业有限公司;JES-FA电子自旋共振仪 日本电子株式会社;C1000 PCR仪美国Bio Rad;DYY-7C型电泳仪北京市六一仪器厂;UV2550紫外分光光度计日本岛津公司。

1.2实验方法

1.2.1海洋放线菌的分离将样品表面清洗干净、晾干。在超净工作台内称取鱼的腮与肠道25 g或贝的内脏25 g,分别放入均质袋内,倒入225 mL灭菌海水均质1 min,形成匀浆状态。吸取10 mL均质液于100 mL的高氏Ⅰ号液体培养基中进行富集培养,28 ℃培养24～48 h。再 10倍稀释合适稀释度并涂布高氏Ⅰ号固体培养基中,28 ℃培养7～10 d,挑取不同形态的单菌落,并在高氏Ⅰ号固体培养基上反复划线纯化[8],将纯化的单菌落进行菌种保藏。

1.2.2产抗氧化活性代谢产物放线菌的筛选

1.2.2.1放线菌发酵上清液制备将分离纯化后的放线菌接种盛有30 mL的高氏Ⅰ号液体培养基中,28 ℃,150 r/min发酵14 d。发酵液 4 ℃,10000 r/min离心10 min,收集上清液并密闭储存4 ℃冰箱,备用。

1.2.2.2产抗氧化活性物质海洋放线菌的初步筛选参考胡喜兰与Kim[9-10]报道的方法,准确称取20 mg DPPH,用无水乙醇溶解并定容至250 mL。按表1进行实验加样,于波长为517 nm测其吸光度,并按以下公式计算DPPH自由基的清除率:

自由基清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

表1　DPPH实验加样表Table 1　DPPH experimental design

1.2.2.3产抗氧化活性代谢产物放线菌的复筛采用电子自旋共振仪(ESR)对初筛有抗氧化活性的菌株进行4种自由基清除率的测定。

DPPH自由基清除活性测定[11]:ESR 操作参数的设置:微波功率5 mW,振幅1×1000,扫描宽度10 mT,调制宽度0.8 mT,扫描时间30 s。将菌株发酵液或DPPH溶液60 μL置于毛细管中,再放入ESR谐振腔中固定,测其谱信号强度,并计算峰高hx或h0。DPPH自由基清除率(%)=(hx/h0)×100。

羟基自由基清除活性测定[12]:ESR操作参数的设置:微波功率1 mW,振幅1×200,扫描宽度10 mT,调制宽度0.1 mT,扫描时间30 s。取0.2 mL 0.5 mol/L的DMPO溶液以及0.2 mL 0.1 mmol/L的FeSO4溶液,混合,再加入0.2 mL的菌株发酵液或磷酸缓冲液(PBS)混合均匀后加入0.2 mL的0.0125%过氧化氢磷酸缓冲液(pH7.0),反应2.5 min后转入毛细管中,记录谱信号强度。羟自由基的清除率(%)=(hx/h0)×100,其中h0和hx分别为体系中加入试样前、后ESR图谱中第2个峰的峰高。

超氧阴离子自由基清除活性测定[11]:ESR操作参数的设置:微波功率10 mW,振幅1×1000,扫描宽度10 mT,调制宽度0.1 mT,扫描时间1 min,中心磁场3475 G。取60 μL 菌株发酵上清液、0.8 mmol/L 核黄素 60 μL、1.6 mmol/L EDTA 60 μL、800 mmol/L DMPO 60 μL,混匀后立即吸入毛细管,放入谐振腔,紫外灯365 nm距样品70 cm 照射1 min后描记 ESR 波谱,以波谱第一峰高值(mm)表示信号相对强度。试样对超氧阴离子自由基清除率(%)=(hx/h0)×100,其中h0和hx分别为体系中加入试样前、后ESR图谱中第1个峰的峰高。

烷基自由基清除活性测定[11]:ESR操作参数的设置:微波功率10 mW,振幅1×1000,扫描宽度10 mT,调制宽度0.2 mT,扫描时间30 s。取10 mL PBS缓冲液(pH7.4),10 μL 40 mmol/L AAPH溶液,10 μL 40 mmol/Lα-(4-吡啶基-1-氧)-氮-叔丁基硝酮(POBN)溶液混合,再加入10 μL菌株发酵液或磷酸缓冲液(PBS)混合均匀后在37 ℃温育30 min后转入毛细管中,记录谱信号强度。试样对烷基自由基清除率(%)=(hx/h0)×100,其中h0和hx分别为体系中加入缓冲液、试样ESR图谱中第2个峰的峰高。

1.2.3抗氧化活性放线菌的16S rDNA鉴定采用16S rDNA通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′与1492R:5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′及Lu报道的菌落PCR方法[13]。反应体系:1.5 μL的10 pmol/μL的27F、1.5 μL的10 pmol/μL的1492R、30 μL的 2×MightyAmp Buffer Ver.2、微量菌体、双蒸水25.5 μL。反应条件:PCR反应条件为:98 ℃ 2 min,98 ℃ 10 s,55 ℃ 15 s,68 ℃ 1 min,40个循环。PCR产物的测序工作由上海英骏生物技术有限公司完成。测序结果用NCBI-BLAST软件在GenBank数据库中进行同源性检索,下载相似性高的相关菌株的模式菌株序列,采用ClustalX 1.81软件进行多序列比对,应用MEGA5.0构建16S rDNA基因系统发育树。

2　结果与分析

2.1海洋放线菌分离及具有抗氧化活性代谢产物菌株初步筛选

从采集到的鱼贝类样品中共分离到具有菌落与培养基结合牢固、不易挑起或者挑起后不容易破碎、颜色多样(呈现淡绿色、褐色、白色、橙黄色、黑色、灰色等)符合放线菌菌落形态基本特征的菌株37株(部分形态见图1),其中,从军曹鱼中分离到23株、龙头鱼中分离到9株、青鳞鱼中分离到3株,翡翠贻贝中分离到2株。采用DPPH-酶标仪法初步筛选到7株对DPPH自由基清除率超过50%的菌株,清除率在50.1%至70.1%范围内。

图1　部分放线菌的菌落形态Fig.1　Colony morphology of part actinomycetes

2.2抗氧化活性放线菌的复筛

对初筛筛选到的7株对DPPH自由基清除率超过50%的细菌再进行电子顺磁共振法(ESR)精确测定DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基及烷基自由基的清除率,综合评价其抗氧化活性强弱。结果显示(见表2),7株菌株中,对DPPH自由基清除率达到50%以上的菌株有3株、对羟基自由基清除率达到50%以上的菌株有6株、对超氧阴离子自由基清除率达到50%以上的菌株有4株,而对烷基自由基基清除率的菌株只有2株。7株菌株发酵液对羟基自由基的清除效果明显优于其它3个自由基的清除,清除率最高的达到了78.2%。另外,对表2进行分析,发现菌株CH16、CH38 这2株菌株发酵液对4种自由基的清除率均超过50%,其中CH16对4种自由基的清除效果均是最好,其抗氧化效果最强。

2.3抗氧化活性放线菌16S rDNA鉴定

对抗氧化活性强的菌株CH16与CH38进行16S rDNA鉴定,PCR电泳结果见图2。将PCR扩增产物测序结果与Eztaxon中标准菌进行比对分析,发现菌株CH16与Amycolatopsisrifamycinica的相似度为99.6%,菌株CH38与Amycolatopsisumgeniensis的相似度为99.3%。从NCBI下载与菌株CH16和CH38 16S rDNA序列相似性高的菌株的序列,并利用MEGA 5.0 软件包中的邻接法构建系统发育树的(见图3),与CH16相似性最高的前15株菌均为拟无枝酸菌属,并且与Amycolatopsisrifamycinica聚在一个分枝,故鉴定菌株CH16为Amycolatopsisrifamycinic;而菌株CH38与相似度高的前15株菌也均为拟无枝酸菌属,但与相似性最高的标准菌Amycolatopsisumgeniensis没有聚在一个分枝,也没有与其它菌株聚在一个小分枝中,故判断其为Amycolatopsissp.,究竟是什么种或者是否是潜在的新种,还需进行细胞壁化学成分分析、G+C含量及DNA杂交等多相鉴定。

表2　7株菌对4种氧化自由基消除率(ESR法)Table 2　Four kinds of the radical scavenging rate for seven strains(ESR)

图2　电泳条带分析图Fig.2　Analysis diagram of the electrophoresis banding 注:M:Mark DL2000。

图3　活性菌株16S rRNA序列系统发育树Fig.3 The Phylogenetic tree of CH16 and CH38

3　结论与讨论

随着化学合成抗氧化剂潜在的毒性及致癌性等副作用的不断报道,其使用越来越受到质疑[14]。近年来,越来越多的新型天然抗氧化剂取代化学合成的抗氧化剂成为新的趋势[15],其中微生物是产生天然抗氧化剂的重要资源[16-17],尤其放线菌由于其丰富的多样性生物代谢能力,是最值得关注与开发的一个微生物类群[18],如benthocyanins、benthophoenin及Carquinostatin等天然抗氧化化合物均来源于放线菌产生的[19],从印度孟加拉湾马拉卡纳姆海岸沉积物中分离到的Streptomyces VITSVK5产生5-(2,4-dimethylbenzyl)pyrrolidin-2-one化合物不仅对DPPH自由基具有高的清除率外,还显示了强的细胞毒活性[20]。本研究从3种海洋动物肠道中分离到7株对DPPH自由基清除率的菌株,表现出海洋放线菌具有产生抗氧化活性物质的能力,其中菌株AmycolatopsisrifamycinicaCH16与Amycolatopsissp. CH38 对DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子清除率和烷基自由基清除率分别为60.3%、78.2%、63.2%、58.9%及50.5%、67.7%、60.2%及55.9%。从韩国济州岛海沙中分离的Nocardiopsissp. S-1对DPPH的清除率为53%[3],Thenmozhi等分离到Streptomycessp. VITSTK7也表现出一定的DPPH自由基清除能力(43.2%),除此以外,它还具有还原Fe3+、阻止氧化剂对DNA损伤的能力[21]。本研究分离到的两株菌对羟基自由基的消除效果最好,而对DPPH自由基的消除效果较弱,孙海红等[22]分离到的3株海洋微生物也对羟基自由基和超氧阴离子自由基有很强的消除效果,也对DPPH自由基清除效果相对较弱。总之,这两株菌株对4种自由基均表现出不同程度的抗氧化生物活性,它们是什么物质、其化学结构、抗氧化机制及其活性稳定性与安全性如何等问题值得进一步深入研究。

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Screening and identification of antioxidant producing marine-source actinomycetes

QIN Man-man,ZHANG Xue-mei,WANG Xiao-jie,FENG Zi-jun,LIU Ying*,QIAN Zhong-ji,WANG Ya-ling

(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

Actinomycetes were isolated from the gastrointestinal tract of four kinds of marine animals by classical culturing technique. Actinomycetes was primarily screened with the method of UV-visible spectrometry to detect the antioxidant activity,then four radical scavenging(DPPH radical,hydroxyl radical,superoxide radical and alkyl radical)were further determined by JES-FA electron spin resonance(ESR)spectrometer. Finally,strains with higher antioxidant activity were identified by 16S rDNA. Results showed that 37 actinomycetes were acquired,and DPPH radical scavenging rates of seven strains were found over 50% by primarily screening method,and DPPH radical scavenging,hydroxyl radical scavenging,superoxide radical scavenging,alkyl radical scavenging of CH16 and CH38 were higher than 50% by ESR method. Also the strain CH16 and CH38 were identified asAmycolatopsisrifamycinicaandAmycolatopsissp.,respectively. This research can provide reference for collecting having antioxidant activity marine actinomycetes resource and further development.

antioxidant activity;metabolic product;marine actinomycete;screening;identification

2015-07-13

秦曼曼(1993-)，女，本科,研究方向：海洋放线菌的分离与鉴定，E-mail:liuyingxk@sina.com。

刘颖(1966-)，女，博士，教授，研究方向：海洋微生物及其应用，E-mail:xuch@gdou.edu.cn。

广东海洋大学大学生创新创业训练计划项目(CXXL 2015043)；广东省科技计划项目(2014A020217018、2014B020205006)；国家自然科学基金(31371777，31171634)；广东省高等学校创新强校项目(GDOU2013050205, GDOU2013050203)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)05-0167-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.05.024