云南省部分兰科植物中总氨基酸的含量测定

俞向东，伏孟瑜，陈路琼，杨盛春*

（1.大理市环保局，云南大理　671000；2.大理大学药学与化学学院，云南大理　671000）

云南省部分兰科植物中总氨基酸的含量测定

俞向东1，伏孟瑜2，陈路琼2，杨盛春2*

（1.大理市环保局，云南大理671000；2.大理大学药学与化学学院，云南大理671000）

目的：对云南省部分兰科植物中总氨基酸的提取条件进行优化，并测定其含量。方法：通过正交试验法优化最佳提取条件，茚三酮显色法在568 nm处测定总氨基酸的含量。结果：最佳提取条件为加入20 mL 75%乙醇，回流提取3次，每次60 min。甘氨酸对照品的浓度与吸光度在0.5～10 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.999 8）。结论：茚三酮显色法操作简便，定量准确，适用于兰科植物中总氨基酸的含量测定。

兰科植物；总氨基酸；含量测定

［DOI］10.3969/j.issn.2096-2266.2016.08.006

兰科植物（Orchidaceae），是高等植物中分布最广、种类最多的一个大家族，为单子叶植物第一大科，全球约700属20 000余种，我国现已查明的兰科植物为170余属13 000余种〔1〕。兰科植物具有很高的药用价值，如天麻（Gastrodia elata）、铁皮石斛（Dendrobium offcinale）、金线莲（Anoectochilus formosanus）等〔2〕。兰科植物中主要含有菲类、联苄、甾体、黄酮类、多糖、氨基酸等成分〔3〕。目前对兰科植物中总氨基酸含量测定的研究报道很少，本文利用溶剂加热回流提取法〔4-5〕提取兰科植物中的总氨基酸，并优化提取工艺条件〔6〕，利用茚三酮显色法〔7-9〕在568 nm处测定不同品种兰科植物中总氨基酸的含量〔10-12〕，为兰科植物中氨基酸的开发利用提供依据。

1　仪器与材料

1.1仪器TU-1901双光束紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；722N可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；T6紫外可见分光光度计（北京普析通仪器有限责任公司）；SB超声波清洗机（宁波新枝生物科技股份有限公司）。

1.2试剂与材料甘氨酸对照品（中国新兴化工试剂研究所，批号：130218）；茚三酮（分析纯）；无水乙醇（分析纯）；兰科属植物，经昆明植物所胡江苗副研究员鉴定为兰科植物属芳香石豆兰（Bulbophyllum ambrosia（Hance）Schltr.）、岩生石仙桃（Pholidota rupestrisHand-Mazz）、叠鞘石斛（Dendrobiumaurantiacum Rchb.f.var.denneanum（kerv）Z.H.Tsi）、岩笋（Thunia alba（Lindl.）Reichb.F），将新鲜的样品晾干粉碎后，过60目筛备用。

2　方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.12%茚三酮溶液的制备精密称取茚三酮约1.0 g置于50 mL量瓶中，加适量无水乙醇溶解后定容，冷藏备用。

2.1.2对照品溶液的制备精密称取甘氨酸对照品0.100 0 g，加蒸馏水溶解后定容至100 mL。

2.1.3供试品溶液的制备精密称取样约1.0 g，置于圆底烧瓶中，加入20 mL 65%的乙醇，加热回流提取3次，每次60 min。过滤，合并滤液，将滤液定容至100 mL，冷藏备用。

2.2最大吸收波长的选择分别精密量取对照品溶液、供试品溶液各2 mL，置10 mL量瓶中，加入茚三酮溶液0.4 mL，摇匀，水浴加热15 min，冷却，蒸馏水定容，以试剂空白作参比，于400～600 nm扫描，对照品溶液和供试品溶液均在568nm处均有最大吸收。

2.3标准曲线的绘制精密移取对照品溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于10 mL量瓶中，按“2.2”项下方法显色后，在568 nm处测定吸光度值。以甘氨酸对照品溶液的浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，得线性回归方程A=0.118 2 C-0.001 5，r=0.999 8，对照品溶液浓度与吸光度在0.5～10 μg/mL范围内线性关系良好。

2.4单因素考察试验

2.4.1乙醇浓度精密称取叠鞘石斛样品5份，每份约1.0 g，置于圆底烧瓶中，分别加入55%、65%、75%、85%、95%的乙醇20 mL，加热回流提取60 min，过滤，用相应质量分数的提取溶剂将滤液定容至100 mL，精密移取2 mL提取液于10 mL量瓶，按“2.2”项下方法显色。结果显示随着乙醇浓度的增加，样品中氨基酸的提取效率逐渐降低，在乙醇浓度为65%时，吸光度值最大。因此选择65%的乙醇为提取剂。

2.4.2乙醇用量精密称取叠鞘石斛样品5份，每份约1.0 g，置于圆底烧瓶中，分别加入10、15、20、25、30 mL的65%乙醇，加热回流提取60 min，过滤，用65%的乙醇将滤液定容至100 mL，精密移取2 mL提取液于10 mL量瓶中，按“2.2”项下方法显色。结果显示随着提取剂用量的增加，样品中氨基酸的提取效率先增加再减小，当乙醇用量为20 mL时，吸光度值最大。因此乙醇最佳用量为20 mL。

2.4.3提取时间精密称取叠鞘石斛样品3份，每份约1.0 g，置于圆底烧瓶中，加入65%的乙醇20 mL，分别加热回流提取30、60、90 min，过滤，用65%的乙醇将滤液定容至100 mL，精密移取2 mL提取液于10 mL量瓶中，按“2.2”项下方法显色。结果显示随着提取次数的增加，样品中氨基酸的提取效率先增加再减小，当提取时间为60 min时，吸光度值最大。因此最佳提取时间为60 min。

2.4.4提取次数精密称取叠鞘石斛样品3份，每份约1.0 g，置于圆底烧瓶中，加入65%的乙醇20 mL，分别加热回流提取1、2、3次、每次60 min，过滤，用65%的乙醇将滤液定容至100 mL，精密移取2 mL提取液于10 mL容量瓶中，按“2.2”项下方法显色。结果显示随着提取时间的增加，样品中氨基酸的提取效率逐渐降低，当提取次数为2次时，吸光度值最大。因此提取2次为最佳提取次数。

2.5正交试验在单因素实验基础上，选择乙醇浓度（A）、乙醇用量（B）、提取时间（C）、提取次数（D）为考察因素，每个因素分别设定3个水平，建立因素水平表。采用L9（34）进行试验，优选最佳提取条件。见表1。

表1　正交试验因素水平

各因素对叠鞘石斛中总氨基酸的提取率影响的主次顺序为A＞C＞D＞B，即乙醇浓度＞提取时间＞提取次数＞乙醇用量。由极差分析可知，最佳提取条件为A3B2C2D3，即乙醇浓度为75%，乙醇用量为20 mL，提取时间为60 min，提取次数为3次。见表2。

表2　正交表L9（34）及试验结果

2.6验证实验精密称取叠鞘石斛样品6份，每份约1.0 g，置于圆底烧瓶中，在最佳提取条件下，按“2.2”项下方法显色后，测定吸光度值。结果总氨基酸RSD为1.4%（n=6）。

2.7方法学考察

2.7.1精密度试验精密移取2 mL叠鞘石斛样品溶液于10 mL量瓶中，按“2.2”项下方法显色后，连续测定6次，计算RSD为1.9%（n=6）。

2.7.2稳定性试验精密移取2 mL叠鞘石斛样品溶液于10 mL量瓶中，按“2.2”项下方法显色后，分别在0.25、0.5、1、2、4、8 h测定其吸收度值，样品溶液显色后在8 h内稳定，RSD为1.5%。

2.7.3重复性试验精密称取叠鞘石斛样品6份，每份约1.0 g，按“2.1.3”项下方法制备样品溶液，按“2.2”项下方法显色后，测定吸光度A，计算RSD值。见表3。

表3　重复性试验结果（n=6）

2.7.4加样回收率试验精密称取叠鞘石斛样品9份，每份约2.8 g，设高、中、低3个浓度，每个浓度各3份，按“2.1.3”项下方法制备叠鞘石斛样品溶液，按“2.2”项下方法显色后，测定吸光度A，计算回收率。见表4。

表4　加标回收率试验结果（n=9）

2.8样品含量测定取不同兰科植物各3份，每份约1.0 g，按“2.1.3”项下制备供试品溶液，精密移取各供试品溶液2 mL于10 mL量瓶中，按“2.2”项下方法显色后，分别测定吸光度，计算总氨基酸的含量。总氨基酸含量的计算公式为：总氨基酸含量，其中C为氨基酸样品液浓度，D为样品液配制过程的稀释倍数，1.599为转换系数，W为样品质量。

不同兰科植物总氨基酸含量差异很大，其中盐笋全株中的总氨基酸的含量是最高的，而芳香石豆兰全株中的总氨基酸的含量是最低的。见表5。

表5　不同兰科植物总氨基酸含量测定

3　讨论

预实验中，比较了溶剂加热回流与超声提取2种提取方法，溶剂加热回流方法提取效率高，所以采用溶剂加热回流提取法。根据所查文献可知，测定氨基酸的方法有：化学法、分光光度法、色谱法和电化学法。对比这4种方法，分光光度法操作简单，定量准确，灵敏度高，相对误差较小，实验成本低，所以本文采用分光光度法来测定兰科植物中的总氨基酸含量。

氨基酸广泛应用于食品行业、医药行业、农业、化妆行业，本文所用的甘氨酸对照品也有很多的用途，例如可以作抗菌剂、食品添加剂、调味剂、保鲜剂，此外还有调节人体胃液，延缓皮肤衰老等作用。随着生活水平的提高，人们对氨基酸类物质的需求越来越多，研究氨基酸是十分有意义的。本文研究兰科植物中的总氨基酸提取工艺条件和含量，可为开发利用兰科植物中的氨基酸提供依据。

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〔Abstract〕Objective：To optimize the extraction technology of total amino acids from parts of Orchidaceae plants in Yunnan and determine the content.Methods：The best extraction conditions were optimized by orthogonal test，and the content of total amino acids was determined in 568 nm through Nihydrin colorimetry method.Results：The best extraction conditions were as follows:20 mL 75%ethanol，3 times of reflux extraction and 60 min for each time.The concentration and the absorbance of the GLY show a good linear correlation when changing from 0.5 μg/mL to 10 μg/mL，r=0.999 8.Conclusion：Nihydrin colorimetry method is simple，accurate，which can be used for the determination of total amino acids in Orchidaceae plant.

〔key words〕Orchidaceae plant；total amino acids；content determination

（责任编辑李杨）

Determination of the Contents of Total Amino Acids in Parts of Orchidaceae Plants in Yunnan

Yu Xiangdong1，Fu Mengyu2，Chen Luqiong2，Yang Shengchun2*
（1.Dali Municipal Environmental Protection Bureau，Dali，Yunnan 671000，China；2.College of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

R284

A

2096-2266（2016）08-0020-04

国家自然科学基金资助项目（81160393）；云南省教育厅科学研究基金资助项目（2014Y399）

2015-11-26

2016-01-17

俞向东，工程师，主要从事大气和水质监测研究.

杨盛春，副教授.