丁苯酞腹腔注射对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的预防作用及其机制探讨

王鹏，刘华坤，张磊，李玉芝，王凯丽

(济宁市第一人民医院，山东济宁 272000)



丁苯酞腹腔注射对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的预防作用及其机制探讨

王鹏，刘华坤，张磊，李玉芝，王凯丽

(济宁市第一人民医院，山东济宁 272000)

目的观察丁苯酞腹腔注射对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的预防作用，并探讨其可能机制。方法60只成年健康SD大鼠随机分为A、B、C组各20只，A组大鼠腹腔注射400 mg/(kg·d)丁苯酞，B、C组予相同体积生理盐水，共1周。A、B组均制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型，C组仅暴露颈总动脉及分叉处。比较各组大鼠神经行为学评分、脑梗死体积及脑组织凋亡细胞数、核转录因子κB(NF-κB)蛋白、NF-κB mRNA。结果与C组比较，A组和B组神经行为评分、脑梗死体积、脑组织凋亡细胞数及NF-κB蛋白、mRNA阳性细胞数增加；与B组比较，A组神经行为评分、脑梗死体积、脑组织凋亡细胞数及NF-κB蛋白、mRNA阳性细胞数减少；P均<0.01。结论丁苯酞对大鼠脑缺血再灌注损伤有预防作用，其机制可能与抑制NF-κB表达、减少脑组织凋亡细胞有关。

丁苯酞；脑缺血再灌注损伤；核转录因子κB

使缺血脑组织尽快恢复再灌注是治疗脑梗死最有效的方法，然而再灌注往往导致原有缺血脑组织的损害进一步加重，即缺血再灌注损伤。既往研究[1]发现，炎症因子参与到脑缺血再灌注损伤，其中核转录因子κB(NF-κB)信号通路介导的炎症反应在缺血再灌注损伤中起重要作用。丁苯酞具有抗血小板、促进血管生成、改善循环、减少氧自由基生成、抗凋亡等作用，现已广泛应用于脑梗死急性期的治疗中。研究[2]证实，丁苯酞在脑缺血再灌注中产生脑组织保护作用，其机制可能涉及到抑制炎症反应，但确切的分子机制尚不明确。本研究观察了丁苯酞腹腔注射对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的预防作用，并探讨其可能机制。

1　材料与方法

1.1实验动物及药品SPF级SD大鼠60只，体质量220～240 g，清洁级，由济南市药物检验所实验动物中心提供。丁苯酞购自石药集团恩必普药业有限公司。

1.2丁苯酞用法及局灶性脑缺血再灌注损伤模型制备60只SD大鼠随机分为A、B、C组各20只，A组大鼠腹腔注射400 mg/(kg·d)丁苯酞，B、C组予相同体积生理盐水，共1周。A、B组用线栓法制备局灶性脑缺血再灌注损伤模型，缺血2 h，将线栓退至颈外动脉残端恢复再灌注24 h后做相应处理。不符合模型要求的剔除，并及时补遗。C组仅暴露颈总动脉及分叉处。术中均用白炽灯使其肛温维持在体温水平，术后单笼饲养。

1.3大鼠神经功能评价于再灌注24 h时按文献[3]等级评分法对神经功能进行评分，无明显神经缺损症状计0分，不能伸展对侧前肢计1分，行走时向对侧旋转计2分，行走时向对侧倾倒计3分，不能自行行走伴意识丧失计4分。

1.4大鼠脑梗死体积测算每组随机选取6只大鼠，于再灌注24 h后麻醉并断头取脑，自额极2 mm向后连续等距切取5个冠状脑片，间距2 mm，2%TTC 37 ℃避光染色10 min。正常脑组织染为红色，梗死组织为白色。梗死体积=各层梗死面积之和×层间隔(2 mm)。

1.5大鼠脑组织凋亡细胞数观察采用TUNEL法。高倍镜下(400×)在梗死灶周围随机取4个视野，计数凋亡细胞核数(胞质)；正常神经细胞核呈蓝色，细胞核中有棕黄色或黄褐色颗粒定义为阳性表达，即凋亡细胞。

1.6大鼠脑组织NF-κB蛋白、mRNA检测取各组剩余14只大鼠，麻醉后取仰卧固定，依次用生理盐水、4%甲醛溶液各250 mL经心脏灌注固定，断头，完整取脑，置于4%甲醛溶液后固定2 h，蒸馏水浸泡6 h。常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。冠状位切片后4 ℃保存，免疫组化和原位杂交备用。①NF-κB蛋白检测：采用免疫组化法。石蜡切片脱蜡至水，按SABC免疫组化试剂盒说明染色，DAB显色。光镜下观察胞质或胞核有棕黄色颗粒者为阳性细胞。所有切片均在同一光强度、放大倍数下进行观察，每张切片先在低倍镜下随机选择额顶叶梗死灶周围区4个象限视野，然后在高倍镜下(400×)选择缺血灶周围5个不连续的视野计数阳性细胞，取其平均值为该张切片的阳性细胞数。②NF-κB mRNA检测：采用原位杂交法。石蜡切片常规脱蜡至水，灭活内源性酶；滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶暴露mRNA核酸片段；室温后固定10 min，严格按照原位杂交检测试剂盒操作程序进行。阳性细胞胞质呈棕黄色。所有切片均在同一光强度下，同一放大倍数下进行，每张切片先在低倍镜下随机选择额顶叶梗死灶周围区4个象限视野，然后在高倍镜下(400×)选择缺血灶周围5个不连续的视野计数阳性细胞，取其平均值为该张切片的阳性细胞数。

2　结果

2.1两组神经行为评分、脑梗死体积、脑组织凋亡细胞数比较神经行为评分、脑梗死体积、脑组织凋亡细胞数比较见表1。

表1　两组神经行为评分、脑梗死体积、脑组织凋亡细胞数比较

注：与C组比较，aP<0.01；与B组比较，bP<0.01。

2.2两组脑组织NF-κB蛋白、mRNA表达比较脑组织NF-κB蛋白、mRNA表达比较见表2。

表2　两组脑组织NF-κB蛋白、mRNA阳性表达细胞数比较(个，

注：与C组比较，aP<0.01；与B组比较，bP<0.01。

3　讨论

目前，随着溶栓治疗的普及和神经介入工作的开展，其成为脑梗死血管再通的有效治疗方法，然而再灌注早期可能导致致死性脑水肿，出血转化，神经血管损伤，甚至脑组织死亡。因此，研究潜在内源性神经保护机制在治疗缺血再灌注损伤时所起的作用尤为重要。炎症因子的表达、炎症反应的异常亢进、神经细胞的凋亡在脑缺血再灌注损伤过程中起重要作用[4]。

NF-κB作为机体广泛存在的转录因子，在调控细胞增殖、凋亡及炎症反应等靶基因的表达中起重要作用。在脑缺血、脑外伤、蛛网膜下腔出血等均有NF-κB参与[5～7]。大量证据表明，脑缺血再灌注损伤时，NF-κB信号通路激活，导致脑组织损伤加重[1,5,8]。在MCAO的动物模型中，发现恢复再灌注30 min时脑组织NF-κB DNA表达明显增加[9]。在缺血再灌注时，NF-κB激活导致TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达变化，加重脑组织损害，抑制NF-κB激活时改善实验大鼠神经缺损评分、减少脑梗死体积、减轻脑水肿、降低凋亡细胞数，相应TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达减少[10]。另外，NF-κB P50亚基缺陷大鼠在缺血再灌注时脑组织损伤明显降低[11]；而缺血后以药物处理，发现异氟烷、芍药苷等通过抑制NF-κB的激活，减少脑组织的损害，产生神经保护作用[12～14]。

目前，丁苯酞已广泛用于脑梗死的治疗中。研究[15～17]发现，丁苯酞通过改善线粒体功能，抑制自由基，维持血脑屏障的完整性，减少脑梗死面积，产生神经保护作用。文献[2]报道，丁苯酞能抑制炎症因子NF-κB、TNF-α、IL-6炎症因子表达产生神经保护作用。丁苯酞腹腔注射可抑制大脑皮层炎症细胞浸润，使神经细胞及细胞结构损伤减轻[18]。任建宏等[19]发现，丁苯酞腹腔注射能够抑制TLR4及内源性配体的表达，进而抑制炎症反应的发生，发挥脑保护作用。另外，丁苯酞在大鼠缺血再灌注的模型中能够通过抑制细的凋亡，从而对缺血再灌注所导致损伤起到神经保作用，并且改善效果与缺血再灌注的时间及给予丁苯酞的时间有密切关系[20]。

总之，丁苯酞对大鼠缺血再灌注损伤有预防作用，其机制可能与抑制NF-κB表达、减少脑组织凋亡细胞有关。

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王凯丽(E-mail: wangkaili20033@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.012

R743.3

A

1002-266X(2016)15-0038-03

2015-12-17)