牛黄解毒片的显微鉴别及薄层鉴别

尹 丽，张潇菡,2，马丽娟，蒲晓辉，袁 琦，宗兰兰

1. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004； 2. 许昌市中心医院，河南 许昌 461000； 3. 宁夏医科大学总院儿童医院 药剂科，银川 750004； 4. 河南大学 纳米材料工程研究中心，河南 开封 475004



牛黄解毒片的显微鉴别及薄层鉴别

1. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004； 2. 许昌市中心医院，河南 许昌 461000； 3. 宁夏医科大学总院儿童医院 药剂科，银川 750004； 4. 河南大学 纳米材料工程研究中心，河南 开封 475004

〔目的〕 对牛黄解毒片进行显微鉴别，并使用薄层色谱对其中的6种有效成分进行二次展开。 〔方法〕 先在显微镜下观测大黄特有的簇晶，确定鉴别对象有大黄。然后，以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.36)为鉴别大黄5种成分(芦荟大黄素、大黄素、大黄素甲醚、大黄酸、大黄酚)的一次展开剂，以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)为分离出黄芩苷的二次展开剂。〔结果〕 通过显微鉴别可以清晰地看到大黄簇晶，且通过二次展开可以在薄层板上清晰地看到分离的6种成分与相应的标准品在相同的位置。 〔结论〕 结果表明，此方法简便、分离斑点清晰、重现性好、专属性强，可为重新制定牛黄解毒片的鉴别标准提供依据。

牛黄解毒片；显微鉴别；薄层鉴别；大黄；黄芩

牛黄解毒片源于元代《咽喉脉证通论》的清热解毒名方，至今已有800多年的历史[1]，临床主要用于火热毒邪炽盛于内及上扰清窍导致的咽喉、牙龈肿痛、口舌生疮、目赤肿痛等。处方始现于明《证治准绳·幼科》中，本命名为牛黄解毒丸，后经改变处方中的几味中药材成为牛黄解毒片。现处方由大黄、黄芩、冰片、桔梗、人工牛黄、甘草等 8 味中药材组成[2]。以牛黄、大黄、黄芩、石膏为君药，清热解毒，泻火通便；辅以冰片、雄黄(为臣药)解毒清热，佐以桔梗清利咽喉；使以甘草解毒、调和诸药，共奏解毒清热之功[3]。不仅可以内用清热解毒，还可以外用治疗腮腺炎、乳腺炎、疖肿、虫咬性皮炎、带状疱疹、药物性静脉炎及化脓性中耳炎等疾病[4]。

牛黄解毒片现为《中国药典(一部)》所收载，为广泛运用的非处方药，一直深受患者青睐[5-7]。目前，全国约有1 500家药厂生产该药，各药厂生产工艺、设备、操作都有所差异，原料来源也不相同，故质量参差不齐。关于牛黄解毒片的鉴别，现行的方法不严格、不全面，大多文献记录的是，将大黄和黄芩分别点在不同的薄层板上进行薄层鉴别。我们尝试对牛黄解毒片进行显微鉴别，并利用二次展开法鉴别其中的某些重要成分。

1　实验与结果

1.1仪器与试剂

双目生物显微镜XPS-2CA(上海光学仪器一厂)；Motic DigiLabll-网络数码互动实验系统(河南百思惠宇信息工程有限公司)；WHF-203B三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司)；AB135-s梅特勒-托利多B-S系列天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

牛黄解毒片样品(北京同仁堂科技发展股份有限公司制造，生产批号为13120667，规格为0.27 g/片)。对照品：大黄对照药材(卫生部药品生物制品鉴定所提供，生产批号为8501)，黄芩对照药材(卫生部药品生物制品鉴定所提供，生产批号为8412)，黄芩苷对照品(上海源叶生物科技有限公司提供，生产批号为ZN114LA13)，芦荟大黄素对照品(上海源叶生物科技有限公司提供，生产批号为20131112)，大黄酸对照品(上海源叶生物科技有限公司提供，生产批号为HS0905KA13)，大黄素对照品(上海源叶生物科技有限公司提供，生产批号为20131203)，大黄酚对照品(上海源叶生物科技有限公司提供，生产批号为20130320)，大黄素甲醚对照品(上海源叶生物科技有限公司提供，生产批号为20130629)。其他试剂均为分析纯。

1.2显微鉴别

取牛黄解毒片样品2片(去糖衣)，研磨成粉末状；取适量粉末于载玻片上，经水合氯醛在酒精灯上进行透化后，放上盖玻片；用显微镜进行观测。结果如图1所示：通过显微镜可观测到草酸钙簇晶，其直径大约为100 μm(在60～140 μm之间)。这是大黄所特有的草酸钙直径范围，表明该样品中含有大黄药材。

图1　生物显微镜图

1.3薄层鉴别

1.3.1供试品溶液的制备取牛黄解毒片样品1片，研磨至粉末状，加甲醇20 mL，超声处理15 min；抽滤后，量取10 mL滤液，旋蒸至干；用10 mL水溶解残渣，加1 mL HCL，加热回流30 min；放冷后，用氯仿萃取2次，每次20 mL；合并两次的氯仿液，旋蒸至约有1 mL[3]，作为鉴别本品中大黄的供试品溶液。

取牛黄解毒片样品4片，研磨至粉末状，加乙醚30 mL，超声处理15 min；抽滤后，将滤饼放在通风橱里，放至无乙醚；用30 mL甲醇溶解残渣，超声处理15 min；抽滤，将滤液旋蒸至挥干，用20 mL水溶解残渣，用HCL调pH=2；加30 mL乙酸乙酯，摇荡，取乙酸乙酯层，旋蒸至挥干；用适量甲醇溶解残渣[3]，作为鉴别本品中的黄芩的供试品溶液。

1.3.2对照品溶液的制备精密称取适量芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚对照品，分别用甲醇定容，制成约为2 g/L的对照品储备液；精密量取适量上述5种对照品储备液于同一容量瓶中，用甲醇定容制成5种大黄成分的混合对照溶液；精密称取适量黄芩苷对照品，用甲醇制成2 g/L的黄芩苷对照品溶液；精密称取大黄对照药材0.2 g，加3 mL甲醇，超声处理5 min，抽滤，滤液即为大黄对照药材标准溶液。同法取黄芩对照药材制备黄芩对照药材标准溶液。

1.3.3展开采用二次展开法将大黄的5种成分和黄芩苷展开在同一薄层板上，点样顺序为：大黄供试品溶液，5种成分的混合对照品溶液，大黄药材溶液，黄芩供试品溶液，黄芩对照品溶液，黄芩药材溶液。先以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.36)为展开剂，先将30 mL展开剂倒入洁净的层析缸里，再将点好的硅胶G板放入其中，30 min后取出，展距约为13 cm。再以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)为展开剂，同样取30 mL展开剂进行展开，展开到大黄的最下边的大黄酸之前取出，展距大约5 cm。可以观察到，在与对照药材和对照品溶液相同位置的薄层板上，供试品溶液显相同的黄色(大黄成分)或者黑色(黄芩苷)的荧光斑点，从图2可以看出，牛黄解毒片中6种成分分离都较好。

图2　各种溶液在紫外灯下的薄层色谱图

1.3.4其他检视方法

另外，采用不同的检视方法得到图3所示结果。其一是，将晾干的二次展开后的薄层板放在装有适量的氨液的层析缸中，平衡15 min，取出，吹干至无氨臭。于日光下检视，可以看到，含有大黄的各种溶液，显相似的红斑。其二是，在二次展开的薄层板上，喷适量的质量分数为2%的三氯化铁乙醇液，可以看到，含有黄芩苷的供试品、对照品及对照药材溶液在薄层板的相近高度，显示相同的黑色斑点。

2　讨论

在确定分离大黄5种成分的展开剂时，首先尝试了环己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)，结果显示芦荟大黄素和大黄酸的黄色斑点大部分重叠没有分离开。为了分开芦荟大黄素和大黄酸，又尝试以苯、甲酸乙酯、甲醇、甲酸、水(3∶1∶0.2∶0.05∶0.5)为展开剂[8]，振摇混匀，分层后立即用上层液上行展开，结果显示芦荟大黄素与大黄酸分离较好，但大黄素甲醚与大黄酚两者的黄斑重叠未分离开。以正己烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、水(3∶1∶0.2∶0.05∶0.5)为展开剂，对大黄的5种成分进行展开，结果显示芦荟大黄素和大黄酚两者的黄斑仍有重叠未能分离开。将环己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)中的环己烷换成正己烷[9]，结果显示芦荟大黄素和大黄酸的黄斑仍有部分重叠未能分离开。考虑到这可能是因为甲酸的比例偏大，故在正己烷和乙酸乙酯用量不变的情况下，多次调整甲酸的用量，发现以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.36)为展开剂时可将大黄5种成分成功的分离。因黄芩苷极性较大，将大黄和黄芩的有效成分展开在同一薄层板上时，选择二次展开法。先以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.36)为展开剂，分离大黄的5种成分；再以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)为展开剂，分离出黄芩苷，可采用多种检视手段对牛黄解毒片中6种成分进行同时鉴别。二次展开法，省时、方便、准确，为进一步完善牛黄解毒片质量控制的方法提供依据。

图3　各种溶液在日光下的薄层色谱图

温度与湿度的掌握对实验能否成功有较大影响。实验证明，温度控制在24～30 ℃为宜，温度过低会导致大黄酸与芦荟大黄素分不开；湿度应该控制在43%以下，湿度过大会导致分离结果不理想。可能是湿度过大，硅胶板变潮湿，改变硅胶板的性质。

在提取大黄和黄芩供试品溶液时，尝试以甲醇为溶剂，用超声处理供试品粉末15 min。结果是大黄素甲醚在硅胶板上很难显现，在可见光下大黄的其他成分颜色也很淡，说明此方法提取的目标成分太少。

在制取大黄供试品溶液时，我们参考了药典方法[2]，对甲醇超声提取液蒸干重溶回流后用氯仿代替乙醚进行分液提取，旋蒸滤液至1 mL制备大黄供试品溶液。这样改进药典方法，减少了蒸干乙醚再加氯仿的麻烦，同时发现供试品溶液中目标成分明显增多。

对牛黄解毒片进行显微鉴别，可以清晰地看到草酸钙簇晶。根据《中国药典(2015年版)》的规定，大黄簇晶是药品中含有大黄药材的重要标志，故显微鉴别为薄层鉴别大黄打下基础。采用二次展开薄层色谱法鉴别牛黄解毒片，可将样品中的6种有效成分检出.此方法简便，分离的斑点清晰稳定、重现性好，可为重新制定牛黄解毒片的鉴别标准提供依据。

[1] 封玉玲，苗加伟，李晶，等. 牛黄解毒片的安全性评价[J]. 中国中药杂志，2014,9(17):39.

[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典( 一部) [S]. 北京：中国医药科技出版社，2015:566-567.

[3] 潘丽丽，李亭亭，杨颂，等. HPLC 法同时测定牛黄解毒片中黄芩苷、黄芩素、芦荟大黄素、大黄素的含量[J]. 中医药学报，2015,43(1):50-53.

[4] 胡翔. 外用牛黄解毒片能治疗哪些疾病[J]. 求医问药，2005(1):34-35.

[5] 谢冠群，韩春雯，范永升. 中医“火”源流考[J]. 中华中医药杂志，2013,28(3):591-594.

[6] 何淼泉，鲍玺，温成平. 火热证候的临床特征[J]. 中华中医药杂志，2013,28(3):791-792.

[7] 张国玺. 上火初释[J]. 药物与人，2007,7(11):91.

[8] 张秋红，刘素清，熊绍银. 大黄素成分的薄层分析条件综述[J]. 时珍国医国药，2000,11(4):372.

[9] 郭金堂. 牛黄解毒片中大黄的薄层鉴别[J]. 中国中药杂志，1992,17(12):735-736.

[责任编辑段金卯]

Microscopic Identification and TCL Identification of Niuhuang Jiedu Tablets

1. Institute of Materia Medica, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 2. Xuchang Central Hospital, Henan Xuchang 461000, China; 3. Pharmacy Department of The Children Hospital, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 4. Engineering Research Center for Nanomaterials, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China

〔Objective〕Six active ingredients were analyzed by TLC with second outspread method with the microscopic identification of Niuhuang Jiedu Tablets.〔Methods〕First, to determine the identification of objects with rhubarb by observeding the rhubarb unique crystal clusters under a microscope. Then, the five active ingredients of rhubarb (aloe emodin, emodin, emodin ether, rhein, chrysophanol) were distinguished with hexane-ethyl acetate-formic acid (30∶10∶0.36) as the primary developing solvent; and the baicalin was isolated with ethyl acetate-butanone-formic acid-water (10∶7∶1∶1) as secondary developing agent.〔Results〕Rhubarb crystal clusters can clearly see by microscopic identification. And you can clearly see the position of the six components in TLC plate through the secondary expansion of the same standard with the corresponding separated.〔Conclusion〕The method is handy and clearly separated spots with a good sensitivity and reproducibility, and it can provide the basis for the re-enactment Niuhuang jiedu identification standards.

niuhuang jiedu tablets; microscopic identification; TLC, Rhubarb; Skullcap

1672-7606(2016)02-0085-04

2016-03-17

NSFC-河南人才培养联合基金资助项目(U1304826)；河南省科技攻关计划项目(152102310077)

：尹丽(1992-)，女，河南信阳人，硕士，从事中药新剂型与新技术工作。

宗兰兰(1989-)，女，河南开封人，硕士，助理实验师，从事纳米材料研究工作。

TQ460.72

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