菝葜体外抗肝癌细胞活性物质筛选

吴先闯，宋卫中，宋晓勇，康文艺，侯彦涛，张永州，张晓坚，张凌云，卢 红，刘瑜新

1. 河南大学 淮河医院，河南 开封 475001； 2. 河南大学 中药研究所，河南 开封 475004； 3. 河南省医药学校，河南 开封 475003； 4. 郑州大学 第一附属医院，郑州450052



菝葜体外抗肝癌细胞活性物质筛选

1. 河南大学 淮河医院，河南 开封 475001； 2. 河南大学 中药研究所，河南 开封 475004； 3. 河南省医药学校，河南 开封 475003； 4. 郑州大学 第一附属医院，郑州450052

〔目的〕 筛选菝葜抗肝癌细胞的活性物质，为临床应用菝葜辅助治疗肝癌提供实验依据。〔方法〕 采用不同工艺制备菝葜提取物，将菝葜提取分离为乙醇粗提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位，利用MTT法检测4种物质部位对肝癌细胞H22、HepG-2、BEL-7402的体外生长抑制。〔结果〕 从菝葜分离提取的4种物质部位均有不同程度抗肝癌细胞活性，其中乙酸乙酯部位抗肝癌细胞增殖活性最强，并在浓度范围内呈现良好的量效关系。〔结论〕 乙酸乙酯部位为菝葜主要抗肝癌细胞活性物质。

菝葜；肝癌细胞；乙醇提取物；乙酸乙酯部位

肝癌是一种十分常见的恶性消化道肿瘤，其病死率高、危害性大，已经位居世界肿瘤性疾病的第 3 位，且有逐年升高的趋势[1]。大多数病例在确诊时肝功能储备已很差，化疗药的细胞毒性会进一步损害正常肝细胞，使肝脏功能进一步恶化。因此，寻找和开发高效低毒的抗肝癌药物具有十分重要的意义。菝葜(SmilaxchinaL.)为百合科菝葜属植物，又名铁菱角、金刚藤、王瓜草、金刚树，性平，味甘酸，其根、茎、叶均可入药，尤以根茎入药最为常见。该中药收载于《中国药典》2015 版一部，具有利湿去浊、祛风除痹、解毒散瘀的功能[2]。民间常用于风湿性关节痛及恶性肿瘤(如食管癌、胃癌、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌等)的治疗。菝葜是中医临床治疗肿瘤疾患的常用配伍组方药味。有人[3-6]报道菝葜的黄酮类、鞣质类成分具体外抗肺癌作用，菝葜皂苷及乙酸乙酯提取物具有抗肿瘤作用，菝葜的醋酸乙酯部位在抗炎和抗肿瘤方面有着独特的疗效[7]。其乙醇提取物的各萃取部位抗肝癌生物活性尚未见文献报道。我们采用乙醇提取，经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取后得到3个化学部位，观察菝葜乙醇提取液及3个化学部位抗肝癌活性，探讨菝葜抗肝癌的单一活性部位，从而使有效物质富集度高，药效物质相对明确，药理活性相对稳定，为进一步利用菝葜抗肝癌提供实验数据。

1　材料

1.1药材与试剂

中药菝葜购于开封市天济堂药店，经河南大学药学院中药鉴定学丛悦教授鉴定为百合科植物菝葜(SmilaxchinaL.)的根茎。

RPMI1640培养基(美国 Gibco-BRL 公司)，胎牛血清(天津市源洋生物制品科技有限责任公司)，0. 25% 胰蛋白酶(美国 Gibco公司)，二甲基亚砜(DMSO)(美国Sigma-Aldrich 公司) ，3-(4,5二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT，美国Ameresco)。其余试剂均为分析纯。

1.2细胞株

小鼠肝癌H22细胞由河南大学药学院提供，体内接种传代保存。人肝癌BEL-7402、H epG2细胞株(美国 ATCC 公司)，在含体积分数为10%的胎牛血清的RPMI 1640培养液中培养，其内加入青霉素(100 μmol/L)、链霉素(100 μmol/L)，置于体积分数为5%的CO2饱和湿度培养箱内培养，2.5 g/L胰酶消化传代。

1.3仪器

CO2恒温培养箱(Sanyo Forma，日本)；HDL 洁净台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)；UV-2000型紫外-可见光分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)；LGR16-W 型高速冷冻离心机(北京京立离心机有限公司)；800 型酶标仪(Bio-Tek)；Forma 3110 CO2培养箱；96 孔细胞培养板(美国Costar公司)；XDS-500D 型倒置荧光显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)。

2　方法

2.1供试药物的制备

取中药菝葜干燥根茎，分别用10倍量体积分数为65%的乙醇热回流提取3次，每次提取1 h，过滤，收集提取液；药渣再用10倍量体积分数为50%的乙醇热回流提取3次，每次提取0.5 h，过滤，收集滤液；将2次不同浓度的乙醇提取液合并，减压回收溶剂，浓缩至浸膏状，得菝葜乙醇总提物。用适量热蒸馏水将菝葜乙醇总提物浸膏进行分散，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯和水饱和正丁醇萃取3～5次并减压回收每个萃取部位溶剂，浓缩后分别得石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。

将乙醇总提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位溶解于DMSO，然后用含体积分数为10%的胎牛血清的RPMI-1640培养基稀释成相应浓度，备用。

2.2供试品对体外培养肿瘤细胞生长的影响

小鼠肝癌H22细胞体内接种传代。人肝癌BEL-7402、HepG-2细胞均为贴壁细胞，将复苏好的细胞置于含体积分数为10%的胎牛血清、10万U/L的青霉素、100 mg/L的链霉素的RPMI-1640培养基中，在温度为37 ℃、相对湿度为95%、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，每日观察细胞生长情况。BEL-7402和HepG-2细胞 3～4 d传代1次。

取接种肿瘤 7 d 后且生长良好的H22肝癌腹水型荷瘤小鼠，将其颈椎脱臼处死，在无菌条件下抽取乳白色腹水，细胞经PBS液洗涤2次(1 000 r/min，5 min)，调整细胞数 5×104个/mL；同时取对数生长期的HepG-2、BEL-7402细胞用0.25%胰酶消化，调整细胞数 5×104个/mL。将上述3种细胞以每孔100 μL接种于96孔板中。培养24 h，待细胞贴壁后，吸弃上清液，于上述96孔板中加入不同浓度的待测样品液100 μL(使终质量浓度分别为10 mg/L、25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L)，每个浓度平行6个复孔。以0.1%的DMSO作空白于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，48 h后除去培养基，加含MTT0.5 g/L的PBS每孔100 μL，继续培养4 h 后除去孔内的液体，加入DMSO每孔10 μL，震荡10 min，在酶标仪上570 nm处测吸光度A。则

2.3数据处理

3　结果

菝葜提取物对H22、HepG-2、BEL-7402三种细胞生长的影响与对照组比较，菝葜乙酸乙酯部位组抑制肝癌细胞的存活率最强，菝葜乙酸乙酯部位抗肝癌细胞活性优于其乙醇粗提物和石油醚及正丁醇部位，并具计量效应关系，见图1。

图1　菝葜不同萃取部位对3种肝癌细胞增殖抑制的影响

4　讨论

菝葜具有多方面的生物活性，

其有效成分具有

抗炎镇痛、活血化瘀、免疫抑制、抗氧化和抗肿瘤等多种药理作用[8]。我们通过对菝葜进行乙醇提取，然后利用不同溶剂进行萃取，得到菝葜乙醇总提物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。选取小鼠肝癌细胞H22和人肝癌细胞HepG-2、BEL-7402为实验用细胞株，采用MTT法测定菝葜醇提物及各萃取部位对3种肝癌细胞的活性影响，比较了菝葜不同部位对3种肝癌细胞的抑制活性作用强弱。研究结果表明，菝葜乙酸乙酯部位对3种肝癌细胞抑制活性最强，且在浓度范围内呈现良好的量效关系，说明菝葜醇提物的乙酸乙酯部位具有良好的体外抗肝癌细胞活性，为进一步诠释菝葜治疗肝癌的物质基础提供实验依据。

[1] Kanda T, Jiang X, Yokosuka O. Androgen receptor signaling in hepatocellular carcinoma and pancreatic cancers[J]. World J Gastroenterol, 2014,20(28):9229-9236．

[2] 国家药典委员会. 中国药典：一部[M]. 北京：中国医药科技出版社，2015:290.

[3] Wu Lisheng, Wang Xiaojing, Jia Aiqun. Cytotoxic polyphenols against breast tumor cell inSmilaxchinaL.[J]. J Ethnopharmacol, 2010(130):460-464.

[4] 邱千，戴琪，陈树和，等. 菝葜体外抗非小细胞肺癌细胞活性物质研究[J]. 中国现代中药，2014,16(1):12-20.

[5] 徐燕，王海燕，蒋家月，等. 菝葜中的甾体皂苷及其细胞毒活性[J]. 中国实验方剂学杂志，2011,17(11):92-96.

[6] 王涛，王鹏．菝葜乙酸乙酯提取物抗癌活性的实验研究[J]. 肿瘤基础及临床，2007,20(3):234-236.

[7] 赵钟祥，冯育林，阮金兰，等. 菝葜化学成分及其抗氧化活性的研究[J]. 中草药，2008,39(7):975-977.

[8]罗艳琴，马云，宋路瑶，等. 菝葜有效成分及其药理作用研究概述[J]. 中药材，2013,36(3):502-504.

[责任编辑李武营]

Screening of anti-HCC Components from Rhizomes of Smilax china L. in vitro

1. Huaihe Hospital of Henan University, Henan Kaifeng 475001, China; 2. The Institute of Traditional Chinese Medicine, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 3. Henan Fharmaceutical School, Henan Kaifeng 475003, China; 4. The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China

〔Objective〕To Screen anti-HCC active components from the rhizomes ofSmilaxchinaL. and provide experimental basis for clinical application treatment of liver cancer. 〔Methods〕Ethanol crude extracts, petroleum extracts, ethyl acetate extracts and n-butylalcohol extracts were extracted and separated fromSmilaxchinaL. by using solvent method. The survival rates of H22、HepG-2、BEL-7402 were measured by MTT. 〔Results〕All the extracts had different anti-HCC activities tannins showed the best activity against H22、HepG-2、BEL-7402 cells and presented good dose-effect relationship.〔Conclusion〕Ethyl acetate extracts are the main anti-HCC ingredients of the rhizomes ofSmilaxchinaL.

SmilaxchinaL.; hepatoma carcinoma cell; ethanol crude extracts; ethyl acetate extracts

1672-7606(2016)02-0089-03

2016-02-17

河南省科技发展计划项目(144300510019)

吴先闯(1985-)，男，河南开封人，硕士，主管药师，从事临床药学研究工作。

宋晓勇(1972-)，男，河南开封人，主任药师，教授，从事临床药学教学与科研工作。

R979.1

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