薄层色谱法鉴别三黄片中的有效成分

李蒙蒙，田小杏，马丽娟，蒲晓辉，袁 琦，宗兰兰，徐颖峰

1. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004； 2. 宁夏医科大学总院儿童医院 药剂科，银川 750004； 3. 河南大学 纳米材料工程研究中心，河南 开封 475004； 4. 天津天士力现代中药资源有限公司，天津 300402



薄层色谱法鉴别三黄片中的有效成分

1. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004； 2. 宁夏医科大学总院儿童医院 药剂科，银川 750004； 3. 河南大学 纳米材料工程研究中心，河南 开封 475004； 4. 天津天士力现代中药资源有限公司，天津 300402

〔目的〕 探索薄层色谱二次展开同时鉴别三黄片中7种有效成分的方法。〔方法〕 参照薄层色谱法，以硅胶G为吸附剂，先以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)为展开剂，分离三黄片中大黄的5种成分(大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素)，再以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)为展开剂，进行二次展开，分离小檗碱和黄芩苷。分别在波长为365 nm和254 nm的紫外灯下检视。最后分别对三个不同厂家的各三批样品进行了鉴别。〔结果〕 在三黄片供试品溶液的色谱图中可以观察到，三黄片供试品与对照品色谱在相同位置上呈相同颜色的斑点。〔结论〕 通过实验可知，依本实验方案所得薄层色谱图，斑点边缘清晰、重现性好、专属性强、操作简单，可用于三黄片7种有效成分的鉴别。

三黄片；成分鉴定；薄层色谱法

三黄片是一种常用的中成药，2001年被认定为国家第二批非处方药。三黄片具有清热解毒，泄火通便的功能[1]，疗效确切、物美价廉，深受老百姓的喜欢。三黄片收载于《中国药典(2015版)》，因由大黄、盐酸小檗碱、黄芩浸膏三味处方组成，故称“三黄”。通常认为，三黄片是从东汉张仲景《金匮要略》泻心汤方剂得来，由大黄、黄芩、黄连三味药组成，1958年由邯郸制药厂研制成片剂[2]，名为“三黄片”，后来又将处方改为大黄、黄芩和盐酸小檗碱。三黄片是治疗由肠胃湿热引起的赤肿痛、口舌生疮、大便秘结、心胸烦热等症的理想药物。通过临床实践，发现三黄片还有很多新功用[3]，能治疗妇科疾病[4]，外用[5]治疗脓包疮的效果跟红花膏的疗效非常相似[6]，用于治疗急慢性菌痢的效果极好。目前，全国已经有十几家药厂生产三黄片，产品组方及生产工艺都是相对比较稳定和合理的。因其药物制备相对简单，通常由各诊所自己配制成丸剂、散剂或汤剂，所以如何加强和提高三黄片的质量检测手段[7]、保证产品质量，就显得更为重要。然而，三黄片的主要成分没有发生根本变化，本实验对其中主要有效成分——大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、小檗碱、黄芩苷，用薄层色谱二次展开法进行了定性鉴别[7]，实验结果令人满意，方法亦较为简单，为该产品的质量控制提供了一种较为可靠的依据。

1　仪器与试药

1.1实验仪器

WHF-203B三用紫外分光光度计(上海精科实业有限公司)，As3120超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，AB135-s梅特勒-托利多B-S系列天平(瑞士METTLER TOLEDO)。

1.2试剂与样品

试剂：甲醇(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，正己烷(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，丁酮(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)，乙酸乙酯(分析纯，天津市富宇精细化工有限公司)，甲酸(分析纯，天津市津沽工商实业公司)，蒸馏水，硅胶GF254(化学纯，青岛海浪硅胶干燥剂厂，批号140506)，羧甲基纤维素钠(国药集团化学试剂有限公司，批号20140619)。

供试品：三黄片样品1-1、1-2、1-3(湖北襄阳隆中药业集团有限公司，批号121107、121224、130211，规格0.25 g/片)，三黄片样品2-1、2-2、2-3(邯郸摩罗丹药业股份有限公司，批号00613096、00613045、00613058，规格0.25 g/片)，三黄片样品3-1、3-2、3-3(新乡佐今明制药股份有限公司，批号130926、130816、140224，规格0.25 g/片)。

对照品：大黄对照药材(中国食品药品检定研究院，批号120984-201202)，黄芩对照药材(中国食品药品检定研究院，批号120955-201309)，盐酸小檗碱对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号20131219)，黄芩苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号ZN114LA13)，芦荟大黄素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号20131112)，大黄酸对照品批号(上海源叶生物科技有限公司，批号HS0905KA13)，大黄素对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号20131203)，大黄酚对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号20130320)，大黄素甲醚对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号20130629)。

2　试验方法与结果

2.1对照品溶液的制备

分别精密称定芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚5种对照品适量，于容量瓶中加甲醇配制成每1 mL含1 mg的对照品溶液；取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg盐酸小檗碱的对照品溶液；取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg黄芩苷的对照品溶液；取大黄对照药材0.2 g，加甲醇3 mL，超声处理10 min，滤过，取滤液作为大黄对照药材溶液；取黄芩对照药材0.2 g，加甲醇3 mL，超声处理10 min，滤过，取滤液作为黄芩对照药材溶液。

2.2供试品溶液的制备

取三个不同厂家不同批次的三黄片各5片，除去包衣，于研钵中研磨成细粉，精密称定细粉约0.25 g，加甲醇5 mL，超声处理10 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。

2.3药典方法

参照薄层色谱法(2015年版药典第四部)实验，吸取供试品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液、黄芩苷对照品溶液3种溶液各3～5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，分别在365 nm和254 nm紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与盐酸小檗碱对照品色谱相应的位置上，365 nm紫外光下显相同颜色的荧光斑点；在与黄芩苷对照品色谱相应的位置上，254 nm紫外光下显相同颜色的斑点。

再以环己烷、乙酸乙酯、甲酸(12∶3∶0.1)为展开剂，对三黄片中大黄的5种成分进行分离，用供试品溶液、5种成分混合溶液、大黄酸对照品溶液、大黄酚对照品溶液、大黄素甲醚对照品溶液、芦荟大黄素溶液依次点样，展开30 min后，取出，晾干。将薄层板放置在365 nm紫外光灯下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素成分未显示相同颜色的荧光斑点。结果(见图1 )显示，三黄片三种成分——大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素，未分离出来。

图1　供试品在紫外灯下的薄层色谱图

2.4薄层色谱法实验条件

在室温为11 ℃、相对湿度为40%的条件下，用毛细管分别吸取对照品和标准品各3～5 μL点样。点样顺序为：供试品溶液，5种成分混合溶液(大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素)，7种成分混合溶液(大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、小檗碱、黄芩苷)，大黄药材粉末溶液，黄芩药材粉末溶液，小檗碱对照品溶液，黄芩对照品溶液。然后，以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)为展开剂，对三黄片中大黄的5种成分进行分离。30 min后，将薄层板取出，测量其展距约为13 cm。晾干后，再进行二次展开，以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)为展开剂，分离黄芩苷和小檗碱，展至三黄片中大黄最后1种成分芦荟大黄素之前取出，展距约为5 cm。将薄层板取出，放在通风橱内晾干，在波长为365 nm和254 nm的紫外光灯下检视。另外，采用不同的检视方法，将薄层板置氨蒸气熏后，预平衡15 min，取出，热风吹干，展开剂并至无氨臭。最后，喷以质量分数为5%三氯化铁乙醇溶液。

2.5实验结果

将薄层板放置在365 nm紫外光灯下检视，可以观察到供试品溶液色谱中，三黄片中大黄的5种成分和小檗碱在与对照品溶液以及大黄对照药材溶液色谱相对应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，表明三黄片供试品溶液中大黄的5种成分以及小檗碱都能较好地分离。同样，将薄层板置254 nm紫外光灯下检视，能看到供试品溶液色谱中的黄芩苷，在与对照品溶液以及黄芩对照药材溶液相同的位置上显示相同颜色的荧光斑点，结果表明，三黄片供试品溶液中，小檗碱和黄芩苷分离得相对比较好。再分别对三黄片三个不同厂家不同批次样品进行鉴别，其结果见图2、图3、图4。

图2　供试品1在紫外灯下的薄层色谱图

图3　供试品2 在紫外灯下的薄层色谱图

图4　供试品3 在紫外灯下的薄层色谱图

在供试品色谱图中，在与大黄对照品溶液以及对照药材溶液色谱相应的位置上，供试品溶液的5种成分也显相同颜色的红色斑点。用质量分数为5%三氯化铁乙醇溶液对其进行喷洒，可观察到供试品色谱图中，在与黄芩对照药材溶液以及对照品溶液色谱图相对应的位置上，黄芩苷与其显相同颜色的斑点。结果见图5。

图5　供试品3在紫外灯下的薄层色谱图

3　讨论与小结

3.1实验讨论

先用药典方法对大黄的5种成分进行单个分离，结果发现大黄的3种成分(大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素)未分离出来。因为二次展开的方法比药典方法更为简单，更易观察和比较实验结果，所以重新探索分离大黄的方法很有必要。

试验中，最初选择的展开剂为石油醚(60～90 ℃)、甲酸乙酯、甲酸、水(15∶5∶3∶1)，大黄分离较好，黄芩苷和小檗碱无分离。原因可能是石油醚比例太大，后使用石油醚(60～90 ℃)、甲酸乙酯、甲酸、水(10∶7∶3∶1)为展开剂，大黄和小檗碱被成功分离，但黄芩苷仍无分离。据三黄片中有效成分的薄层色谱测定，进行点样。点样顺序为三黄片供试品溶液、7种成分混合溶液(大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、小檗碱、黄芩苷)、黄芩苷对照品溶液。先用二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸(75∶25∶1.5)展开分离大黄，12 min后拿出晾干，分别置365 nm和254 nm紫外光灯下检视，发现黄芩苷停在原点。再用氯仿、乙酸乙酯、甲醇、甲酸(7∶3∶1∶1)分离小檗碱和黄芩苷，发现7种成分混合溶液只有一个点、黄芩苷仍无分离。经分析认为，可能是展开剂中二氯甲烷不合适。再以乙酸乙酯、丙酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)为展开剂进行二次展开，分别在365 nm和254 nm紫外光灯下检视，发现大黄分离不明显、黄芩苷有分离。

继续探索展开剂。以正己烷乙、酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)为展开剂，分离大黄，用供试品溶液、5种成分混合溶液、大黄酸标准品溶液、大黄酚标准品溶液、大黄素甲醚标准品溶液、芦荟大黄素标准品溶液依次点样，结果显示：供试品溶液、5种成分混合溶液、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素分离较好。可以得知，大黄全成分从上到下顺序依次为大黄酚、大黄素甲醚、大黄素、大黄酸、芦荟大黄素。另以乙酸乙酯、丙酮、甲酸、水(10∶8∶1∶1)为展开剂，用供试品溶液、小檗碱对照品溶液、黄芩苷对照品溶液序依次点样，展开，分别在365 nm和254 nm紫外光灯下检视，结果显示：大黄被推至前沿，小檗碱分离较好，黄芩苷没有分离出来。原因可能是丙酮的极性大，所以缩小丙酮的比例，以乙酸乙酯、丙酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)为展开剂，分别在365 nm和254 nm紫外光灯下检视，再用供试品溶液、小檗碱对照品溶液、黄芩苷对照品溶液依次点样，结果显示：小檗碱分离较好；黄芩苷刚开始有分离，但不明显，放置一段时间后斑点近乎消失。再以乙酸乙酯、丙酮、甲酸、水(5∶3∶1∶1)为展开剂，用供试品溶液、小檗碱对照品溶液、黄芩苷对照品溶

液依次点样，分别在365 nm和254 nm紫外光灯下检视，结果显示：供试品、小檗碱、黄芩苷有了较好的分离。喷以质量分数为3%三氯化铁乙醇溶液,在与黄芩苷对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。

3.2实验小结

最后确定，先以正己烷、乙酸乙酯、甲酸(30∶10∶0.5)为展开剂，再以乙酸乙酯、丁酮、甲酸、水(10∶7∶1∶1)为展开济，进行二次展开，并分别对三个不同厂家的三批三黄片进行了鉴别。结果显示，三黄片中7种有效成分分离都较好，在与对照品色谱以及对照药材溶液相应的位置上都显相同颜色的斑点。试验证明，该方法简便易行，斑点分离清晰，重现性好，可用于三黄片有效成分的薄层鉴别。

[1] 中药成方制剂(第12 册)：WS3-B-2278-97[S]. 中华人民共和国卫生部药典委员会，1998.

[2] 王秀，阮正国. 三黄片的研究进展[J]. 中成药，1994,16(2):44.

[3] 潘勇. 三黄片的新用途[J]. 开卷有益—求医问药，2006,19(4):39.

[4] 葛金玉. 三黄片临床新用举隅[J]. 新疆中医药，1997,15(3):55.

[5] 李琦，张文元. 红黄膏治愈脓疱疮48 例[J]. 中医药研究，1994(2):41.

[6] 张文元，辛勇，曹志春. 中西医结合治疗脓疱疮102例[J]. 中国中西医结合杂志，1996,16(2):106.

[7] 王洁，张一鸣，李进冉，等. 市售三黄片中大黄素和大黄酚的含量测定及相关分析[J]. 河北理工大学学报(自然科学版)，2009,31(2):93-99.

[责任编辑段金卯]

The identification of active ingredients three yellow tablets by TLC

1. Institute of Materia Medica, Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 2. Pharmacy Department, The Children Hospital of General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, China; 3. Engineering Research Center for Nanomaterials of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 4. Tianjin Tasly Modern Tcm Resources CO. LTD, Tianjin 300402, China

〔Objective〕To explore the method of secondary separation of the TLC and to identify the seven kinds of effective components in Sanhuang tablets.〔Methods〕To explore the method of secondary separation of the TLC and to identify the seven kinds of effective components in Sanhuang tablets.〔Results〕The testing solution of Sanhuang tablet and the reference substance both showed the same color spots in the same position by TLC.〔Conclusion〕The experiments indicate: According to the image of TLC, the TLC is Spot sharp edges, reliable and specific method with good reproducilility, to be used identification for the seven kinds of effective components in Sanhuang tablets.

Sanhuang tablets; components identification; TLC

1672-7606(2016)02-0081-04

2016-03-17

NSFC-河南人才培养联合基金资助项目(U1304826)；河南省科技攻关计划项目(152102310077)

李蒙蒙(1992-)，女，河南驻马店人，硕士，从事中药新剂型与新技术工作。

宗兰兰(1989-)，女，河南开封人，硕士，助理实验师，从事纳米材料研究工作。

TQ460.72

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