薄层色谱法在药物分析中的应用

尹 丽，宗兰兰，蒲晓辉，李蒙蒙，袁 琦

1. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004； 2. 河南大学 纳米材料工程研究中心，河南 开封 475004



薄层色谱法在药物分析中的应用

1. 河南大学 药物研究所，河南 开封 475004； 2. 河南大学 纳米材料工程研究中心，河南 开封 475004

〔目的〕综述薄层色谱法在药物分析中的应用。〔方法〕对近年来国内外与薄层色谱法的文献进行检索与分析。〔结果〕薄层色谱法在药物分析中的很多方面都有应用。常用于鉴别、杂质检查、含量测定等。 〔结论〕随着现代分析技术的发展，薄层色谱法也得到快速发展，并逐步用于药物分析中的新领域，使其应用更为广泛。

薄层色谱法；鉴别；杂质检查；含量测定

薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)系将适宜的固定相涂于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。待点样、展开后，根据比移值(Rf值)与适宜的对照物按同法所得色谱图的Rf值作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。薄层色谱自1938年发明以来，自身的理论和技术得到了长足的发展，其应用范围极其广泛，成为现代实验室不可或缺的一种技术手段。TLC法被许多国家药典用于药物中杂质的检查、药物分析等方面，且是目前药典中收载最多的鉴别与有关物质检查方法之一，具有设备简单、操作简便、分离速度快、灵敏度和分辨率较高等优点[1]。可以同时分离多个样品，分析成本低，对样品预处理要求低，对固定相、展开剂的选择自由度大，适用于含有不易从分离介质脱附或含有悬浮微粒或需要色谱后衍生化处理的样品分析。在定性鉴定、半定量以及定量分析中发挥着重要作用。但是，在药物分析中应用最为广泛，应用与有机化合物的分析鉴定、植物药有效部位的分离精制、有机合成、结构分析、生物测定等，我们就应用最多的药物分析方面做一综述。

1　TLC用于药品定性鉴别

根据药物的分子结构与理化性质，采用化学、物理化学或生物学方法来鉴别药物，是检验工作的首要任务，是杂质检查和含量测定的前提。因此，药物鉴别在药物质量检查中有着至关重要的地位。另外，薄层色谱法是药物鉴别最基本简便，使用最广泛的方法，分别在化学药品、抗生素、中药材、中成药以及基层药品的鉴别检查中起重要作用。

1.1化学药品及其复方制剂

近年来，TLC法以其快速、简便、准确的特点，在化学药物成分的研究中，原料药的纯度检查、降解产物分析以及制剂的有关物质检查等均可通过薄层色谱法进行。应用薄层扫描法，可以很容易地对合成药物复方制剂或单方制剂进行原料分析和含量测定。扑炎痛中微量杂质的测定可以用CS-930型薄层扫描仪：在硅胶GF254薄层板上，以石油醚、乙酸乙酯、氯仿、冰乙酸(12∶5∶3∶2.5)为展开剂，利用双波长(λs=244nm，λr=280nm)锯齿扫描随行外标法，测定扑炎痛中去乙酰物含量。复方降压胶囊中的组成成分有10种。董海彦[2]以TLC同时鉴别处方中的利血平、利眠宁和盐酸异丙嗪三种成分：取三种对照品及供试品制成溶液，分别点于硅胶GF254板上，以苯、丙酮(3∶2)为展开剂，置254 nm紫外光灯下检视，供试品与对照品的3个斑点位置一致，Rf值适中，斑点明显。Hamryt[3]等用TLC方法研究了12个精神类药物的亲脂性：选用Merck C18硅胶GF254HPTLC薄层板(10 cm×10 cm)，考察了多种流动相组合，结果表明，最好的流动相为甲醇、水、0.01 mol/L的SDS-10%的醋酸盐缓冲液(pH=4.75)、醇、水、1%的氨水、乙腈、水、1%的氨水和二氧六环、水、1%的氨水。波兰Jagiellonian大学的Ekiert等[4]用TLC测定唑类抗真菌剂，这是抗真菌唑类药物成分检测的新方法，目前鲜有报道。该实验对酮康唑、联苯苄唑、氟康唑和伊曲康唑4种抗真菌剂进行了测定：经选择TLC板用硅胶60F254荧光板，展开剂选用正己烷、醋酸乙酯、甲醇、水、冰醋酸(42∶40∶15∶2∶1)，UV检测波长260 nm。该法准确简便，专属性强，可作为抗菌素类药物TLC法研究的参考。

1.2植物药成分的鉴别

TLC法在植物药成分鉴别方面的应用已极为广泛。印度M.S.大学的Murthy等[5]在2008年首次报道了关于莕菜属植中桦木酸的TLC检测方法：将2.5 g N.macrospermum根粗粉用25 mL甲醇溶液水浴加热回流提取30 min，同法提取4次后合并提取液，滤过、离心后制成一定浓度的甲醇溶液；将该样品溶液与桦木酸甲醇对照液同时在TLC硅胶G60F254预制板上点样，用环己烷、醋酸乙酯、冰醋酸(7∶3∶0.03)溶剂系统展开，30 min后取出吹干，并用茴香醛2硫酸溶剂喷淋，110 ℃加热3 min显色，斑点在紫外可见光下检视。结果显示，分离效果良好，Rf=0.60。该方法在桦木酸的检测方面以快速、简便、准确的特点优于其他方法。布达佩斯的Ligor等[6]研究了多种茶叶中活性物质黄酮类的TLC检测方法，提出将经典液相萃取提取方法(liquid extraction，LE)和超临界液体萃取法(supercritical fluid extraction，SFE)作比较，并用TLC法检测在不同提取方法下活性成分的量。该实验中检测的植物有红茶、绿茶和路依保斯茶，对照成分包括芦丁、儿茶酚、咖啡因、橡黄素、山柰酚等。LE法为甲醇溶液浸泡24 h后除去不溶杂质，低温贮藏；SFE法采用SE-1提取器，CO2气体加压(1 151×107Pa)、50 ℃提取。展开剂选用丙酮、氯仿、水(80∶20∶10)，衍生试剂为10 g/L硼酸甲醇溶液和50 g/L质量浓度的乙醇溶液，100 ℃下加热5 min。结果显示，用普通液相萃取提取方法得到黄酮的量较高，分离效果比较理想，Rf=0.28～0.87。

1.3药材及中成药的鉴别

用薄层色谱进行指证性鉴别，它们之间的关系是共性与个性的关系。制备试药生药-共性化合物-共性特征(指示性的)薄层色谱个性化合物、个性特征(Rf值、颜色)薄层色谱，为生药提供了一个可信的“身份”。它可以提供分子水平上的鉴别作用，从而确定是不是认定的生药，是不是道地的生药，是不是已失效的生药。薄层色谱扫描法在中药材与中成药上的应用，主要是药材品种的鉴别、含量的测定、成分研究、采收期与炮制方法等对成分与含量的影响，以及成药中药味的鉴别与含量的测定等。此方法可以直接在薄层板上进行中药成分的定量分析，其扫描图谱也可作为中药材的质量评价、鉴别依据。例如：用薄层扫描法可以鉴别黄连品种，并对其所含生物碱进行定量测定；用薄层扫描法测定土荆皮中乙酸的含量，以帮助鉴别其真伪等。以上事例都是对中药材进行的测定。中成药相对复杂，不单单只包含一味药材制剂，多数为复方制剂，所以在薄层扫描法中，依据色谱峰的归属对中成药中各味药材的鉴别一般是通过阴、阳双对照法进行的。

郑志伟[7]采用双波长扫描法，硅胶G板点样，以正丁醇、冰醋酸、水(7∶1∶2)为展开剂，测定波长425 nm，测定尿塞通片中盐酸小檗碱的含量，线性范围为0.063～0.318 μg，平均回收率为96.97%， RSD为1.71% 。结果表明，该方法操作简便、准确，可用于尿塞通片的质量监控。赵志军等[8]建立了益康胶囊的TLC鉴别方法，对方中组成药物人参、黄芪、何首乌、丹参及甲基橙皮苷进行鉴别。结果显示，斑点清晰，分离效果好，专属性强，阳性对照无干扰。金阳[9]研究破壁灵芝孢子粉胶囊的TLC鉴别方法，通过对集中提取及展开系统的比较，对破壁灵芝孢子粉的鉴别选择GF254板，以石油醚(60～90 ℃)、甲酸乙酯、甲酸(15∶5∶1)的上层溶液为展开剂。结果表明，该法鉴别效果好，能很好地把破壁灵芝孢子粉和灵芝区别开来。

1.4抗生素及其制剂

TLC法在抗生素及其制剂的鉴别以及基层药品快速检验中也经常被使用。同类抗生素的结构很相似，主要显色基团也是一致的，采用颜色反应将其区分比较困难。在快检工作中，利用薄层色谱法在区分结构相似品上具有很好的优势。GF254板，展开剂为乙酸乙酯、丙酮、冰醋酸、水(3∶2∶2∶1)。取出薄层板，置通风处晾干，碘蒸气熏蒸下检视，画出斑点。结果表明，各组分的分离度良好，方法简单、准确，能用于基层克林霉素类抗生素制剂的真伪鉴别。注射用头孢喹啉钠的引入主要目的是同时建立一种单参比的快速薄层色谱鉴别克林霉素类抗生素的方法，这样可以减少对照品的数量、减少误差、提高准确度。

1.5基层药品快速检验

TLC法作为一种快速鉴别方法被配备在药品检测车上，在基层药品现场打假中发挥着重要作用。此外，对于结构类似的同类化合物(十四元环大环内酯类抗生素)检测，简便、灵敏、快速、专属性强的薄层色谱系统的研究是极为重要的。周志凌等[10]建立了一种简单的薄层色谱系统，采用硅胶GF254板，以醋酸乙酯、正己烷、氨水(10∶1.5∶1.5)为展开剂，碘蒸气中显色，用于十四元环大环内酯类抗生素快速鉴别。通过对全国30 家生产企业的样品分析，证明该方法的Rf值适中、实验室重现性好、适宜于基层现场快速鉴别。

2　TLC用于药品中杂质检查

有关物质检查通常采用色谱法，可根据有关物质的性质选用专属性好、灵敏度高的薄层色谱或高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)。薄层色谱法设备简单，操作简便，但因影响重现性和精密度的因素较多，可用作一般有关物质检查。涂莉等[11]采用TLC法，建立了雌三醇栓中有关物质的检查方法：以硅胶G板为吸附剂，以氯仿、甲醇、丙酮、冰醋酸(9∶0.5∶0.5∶0.5)为展开剂；展开后，晾干，喷以体积分数为30%硫酸乙醇液，在100 ℃加热至斑点清晰。结果表明，三种有关物质与原药完全分离，Rf值适中，最低检出量为0.2 pg，且重复性好。采用反相薄层色谱法，建立了阿德福韦酯有关物质检查法：以反相高效F254薄层板(HPTLC RP18 F254)为吸附剂，以甲醇、水(3∶1)为展开剂；在254 nm紫外光灯下检视。结果表明，阿德福韦酯与其有关物质的分离状况良好，检测灵敏度高，最小检测限为0.1 μg。

3　用于药品的含量测定

薄层扫描法也可以测定芪黄胶囊剂中黄芪甲苷的含量。用定量毛细管吸取黄芪甲苷对照品溶液、供试品溶液点样于薄层板上，以氯仿、甲醇、水(13∶6∶2)下层溶液为展开剂，上行展开；在10%的硫酸乙醇中显色，于105 ℃烘箱中烘至斑点显色清晰；分别于390～700 nm范围内进行扫描。采用双波长反射锯齿扫描法，狭缝0.4 mm×0.4 mm，进行斑点光谱分析，得最大吸收波长为520 nm，因此，选定λS=520nm，λR=700nm。在本品含量测定中曾有人采用过高效液相紫外检测器检测，结果不理想，而文中的薄层扫描法简便，结果可靠，稳定性好，可作为该制剂的质量控制方法。

4　用于中药指纹图谱分析

色谱指纹图谱除液相色谱外，还有最常用于中药鉴别TLC。TLC指纹图谱是以原来中国药典的薄层色谱鉴别为依据，通过薄层色谱扫描仪建立的。中药薄层图像指纹图谱TLC的一大优势是提供直观形象的可见光或荧光图像，特征图像非常直观、专属性好、判断速度快，非常适合基层日常分析与现场检验使用[12]。色谱法是中药指纹图谱的主流方法，主要有GC、HPLC、TLC法。TLC法因其便宜、快速、开放性、灵活性等特点，被用于中药指纹图谱分析中。例如白芍总苷，它的HPLC指纹图谱共检出8个色谱特征峰，而TLC色谱指纹图谱在香草醛-硫酸试剂显色的条件下，可见原点部位在内的大约15个有色条斑。袁旭江等[13]研究不同产地广藿香药材薄层色谱指纹图谱的差别，取不同产地广藿香样品6个，采用TLC检测其化学成分。结果表明，不同产地广藿香挥发油部位中成分薄层色谱行为相似，不同产地广藿香甲醇提取部位与石油醚提取部位成分则存在明显差异。崔淑芬等[14]使用薄层扫描法测定不同品种和产地的甘草并建立了指纹图谱，可快速判断药材品质，有效控制甘草质量。所以说，TLC指纹图谱库是一种很好的有利于推进我国中药现代化进程的方法。

5　其他

TLC除了上述的用法外，还常用于为柱色谱选择合适的展开剂，监视柱色谱分离状况和效果，用于判断两个化合物是否相同，用于确定混合物中含有的组分数，用于检测化学反应过程和确定适宜反应温度和时间等其他方面。在天然药物化学中，分离天然产物中的某种特定成分时，为了更好地确定药物分离所需的展开剂，通常会先用TLC法筛选确定最合适的展开剂，使色谱柱分离状况和效果最好。另外，在判断两个化合物是否相同或者混合物所含组分时，我们通常采用TLC法将样品点于板上，若所点的样品显示出相同的颜色与Rf值则说明样品相同或者样品与对照品相同。王雪彦等[15]利用TLC法检查牛奶中是否含有三聚氰胺这一组分。使用硅胶G预制板,以丙酮、氯仿、氨水(7∶0.5∶2)为展开剂，以1%对二甲氨基苯甲醛的盐酸乙醇溶液为显色剂，在365 nm紫外灯下检视，结果显示，我们建立的方法操作简便快速、灵敏度高、成本低，可用于对大量样品的筛查，特别适用于基层的推广应用。

传统TLC技术由于精密度和重现性均较差，曾一度被其他快速发展起来的分离分析技术所取代。20 世纪80年代以来，薄层色谱才得到了更多的关注，这使得薄层色谱法发展成为最简便的色谱技术。它不仅被广泛应用于药物分析中的鉴别、杂质检查和含量测定，因其专属性好、分析速度快、设备简单、操作方便等特点，且被用于基层快检，大大提高了药品抽样阳性率。加之直观、经济、简便的特点，将在中药多样品的分析中发挥更大的作用，使得薄层色谱在中药指纹图谱及手性药物拆分等方面的研究倍受关注。因此，对薄层色谱技术研究的领域也将更加广阔。

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[责任编辑段金卯]

Application of Thin Layer Chromatography (TLC) in pharmaceutical analysis

1. Pharmaceutical College of Henan University, Henan Kaifeng 475004, China; 2. Engineering Research Center of Henan University for Nanomaterials, Henan Kaifeng 475004, China

〔Objective〕This paper review the application of TLC in pharmaceutical analysis.〔Methods〕In this paper, domestic and foreign literatures of TLC in recent years were searched and analyzed.〔Results〕TLC was used of pharmaceutical analysis in many ways, such as identification, drug impurities of check and determination. 〔Conclusion〕With the development of modern analytical techniques, TLC has also been rapid development, and gradually for drug analysis in new areas, making it more widely used.

TLC; identification; impurity testing; assaying

1672-7606(2016)02-0077-04

2016-03-17

NSFC-河南人才培养联合基金资助项目(U1304826)；河南省科技攻关计划项目(152102310077)

尹丽(1992-)，女，河南信阳人，硕士研究生，从事药物新材料的生物安全性研究工作。

TQ460.72

A

袁琦(1976-)，女，河南开封人，硕士，副教授，硕士生导师，从事药物研究工作。