姜黄素抑制哮喘大鼠气道平滑肌细胞TGFβ1表达的研究

杨能力　梁亚峰　李昌崇　张维溪▲　潘国权.温州医科大学附属第一医院麻醉科，浙江温州　5000；.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院儿童ICU，浙江温州5000；.温州医科大学附属育英儿童医院儿童呼吸科，浙江温州　5000

姜黄素抑制哮喘大鼠气道平滑肌细胞TGFβ1表达的研究

杨能力1梁亚峰2李昌崇3张维溪3▲潘国权2
1.温州医科大学附属第一医院麻醉科，浙江温州325000；2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院儿童ICU，浙江温州325000；3.温州医科大学附属育英儿童医院儿童呼吸科，浙江温州325000

［摘要］目的 观察姜黄素对哮喘大鼠气道平滑肌细胞（ASMC）增殖及TGFβ1表达的影响。方法 将24只雄性SD大鼠分为对照组、哮喘组和姜黄素组。以卵清白蛋白（OVA）致敏激发建立哮喘大鼠气道重塑模型，图像分析技术测定支气管壁厚度（Wat）和平滑肌厚度（Wam），免疫组织化学法（IHC）测定肺组织 TGFβ1蛋白表达。酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞培养液中TGFβ1含量，实时定量 PCR（Real-time PCR）检测ASMC中TGFβ1mRNA表达，CCK-8分析ASMC增殖程度。结果 姜黄素组与哮喘组相比，Wat及Wam厚度减少（P＜0.01），仍高于对照组（P＜0.01）；IHC显示：姜黄素组肺组织中 TGFβ1蛋白表达与哮喘组比较明显减少（P＜0.01），仍高于对照组（P＜0.01）。姜黄素组大鼠ASMC中TGFβ1和TGFβ1mRNA表达均降低，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；姜黄素组ASMC增殖明显受到抑制（P＜0.01）。结论 姜黄素能抑制哮喘大鼠ASMC增殖，其机制与降低TGFβ1的表达有关。

［关键词］转化生长因子β1；大鼠；哮喘；气道重塑；姜黄素

支气管哮喘（简称哮喘）（bronchial asthma）的病理特征主要包括气道炎症和气道重塑。气道的结构细胞参与了气道重塑，其中平滑肌细胞（airway smooth muscle cell，ASMC）发生表型改变［1］，参与气道炎症的进程，对哮喘气道重塑发挥重要的作用［2］。转换生长因子（transforming growth factor，TGF）β是一类生物学功能复杂的细胞因子，其中TGFβ1具有促进平滑肌细胞的分化、生长与增殖，肺纤维化等［3］多种生物学效应。由于姜黄素在抗纤维化、抗炎等方面都发挥显著作用，近年来引起了越来越多学者的关注，尤其在哮喘方面的研究。姜黄素既往的研究主要以体内干预为主，但其对特定气道结构细胞培养水平如何发挥抗炎、抗纤维化的作用机制尚未阐明。本研究通过体外培养平滑肌细胞，探讨姜黄素对哮喘大鼠ASMC增殖及TGFβ1表达的影响，揭示姜黄素抑制哮喘气道重塑中ASMC增殖的机制，为其防治哮喘提供科学的实验依据。

1　材料与方法

1.1实验动物

4～6周龄SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，体质量（100～120 g），购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK（沪）2008-003。1.2主要药品与试剂

姜黄素、卵清蛋白（OVA）购自美国sigma公司。TGFβ1小鼠抗大鼠单克隆抗体采购于美国Abcam公司，检测TGFβ1蛋白含量的ELISA试剂盒采购于美国R&D公司；所有内参及TGFβ1引物委托上海生物工程技术有限公司合成。CCK-8试剂盒购自日本同仁公司。

1.3大鼠哮喘模型的复制［4］及给药

24只SD大鼠饲养于SPF级动物中心，按照数字表法分成对照组、哮喘组和姜黄素组，每组8只。实验包括致敏与激发两部分，共10周。哮喘组大鼠分别在第1天、第8天腹腔注射1.5 mL OVA/Al（OH）3混合液［内含OVA 1 mg和Al（OH）3100 mg］进行致敏，对照组使用生理盐水替代。在第15天开始雾化吸入1% OVA，隔天1次，每次30 min进行激发。姜黄素组在激发前30 min用姜黄素（200 mg/kg）灌胃，连续8周。对照组、哮喘组使用0.5%的羧甲基纤维素钠液代替姜黄素灌胃。

1.4动物处理及指标检测

末次雾化吸入12 h内，10%水合氯醛（400 mg/kg）腹腔麻醉，剪开胸腔并分离肺组织，切取右肺相同部位肺组织（肺门上段），固定、包埋及切片，使用HE染色进行病理观察。

1.4.1支气管管壁厚度和平滑肌厚度测量选择直径1000～1500 μm支气管用于检测支气管壁厚度及平滑肌厚度，每只大鼠选3只。通过彩色医学图像分析技术分别测定支气管的总面积（total area of the bronchial，At）和管腔面积（area of tracheal cavity，Ac）、基底膜周径（Perimeter of basement membrane，Pbm），分别测量支气管平滑肌外缘（the external edge of airway smooth muscle，Ame）及内缘（the inner edge of airway smooth muscle，AMi）包含的气管面积。

计算公式：支气管壁厚度（Wat）=（At-Ac）/Pbm

平滑肌厚度（Wam）=（AMe-AMi）/Pbm

1.4.2肺组织中TGFβ1含量检测免疫组织化学法检测肺组织TGFβ1蛋白表达，按照链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶（SP）法说明书进行。Image-pro plus 6.0图像分析软件进行测定，阳性蛋白水平使用平均吸光度（mean optical density，MOD）值表示。

1.5药物干预ASMC及指标检测

腹腔注射10%水合氯醛（400 mg/kg）将大鼠麻醉后，分离肺部组织和气管，去除结缔组织、血管，将剩余气管、支气管剪成1 mm左右组织块，采用I型胶原酶及胰蛋白酶消化。实验使用第2～5代ASMC，待细胞融合至80%时使其同步化。加入姜黄素（20 μmol/L）作用12 h收集ASMC，24 h后收集培养液。对照组中使用等量DMEM培养液作参照。实验重复3次。

1.5.1细胞培养液中TGFβ1含量的检测采用ELISA法检测细胞培养液中TGFβ1含量，所有标本按照试剂盒说明书操作步骤进行。使用Bio-Tek酶标仪（U.S.A）在450 nm处测量吸光度。

1.5.2ASMC中TGFβ1mRNA表达变化 ASMC中TGF β1mRNA表达变化用Real-time PCR法检测。分别收集各组106细胞，Trizol提取总RNA后进行反转录。GAPDH扩增长度为206 bp，TGFβ1为152 bp。GAPDH上游引物：AGACAGCCGCATCTTCTTGC，下游引物CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT；TGFβ1上游引物：ATACGCCTGAGTGGCTGTCT，下游引物TGGGACTGATCCCATTGATT。PCR主要反应条件如下：预变性温度为95℃，90 s；变性温度95℃，5 s；退火温度60℃，30 s；共进行40次循环。

1.5.3ASMC的增殖检测细胞按2.5×104/cm2的密度接种于96孔板，待细胞生长融合至80%时使其同步化于G0期。然后加入姜黄素（20 μmol/L）之后培养24 h。将预热后的CCK-8溶液100 μL加入各个孔中，37℃孵育1 h。酶标仪450 nm处测定OD值，参比波长630 nm。以上步骤独立实验并重复3次。

1.6统计学方法

使用SPSS17.0统计学软件，计量资料用均数±标准差（±s）表示。采用成组设计t检验进行两组样本均数比较；多组样本均数比较采用单因素方差分析，采用LSD或q检验进行均数间两两比较，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2　结果

2.1大鼠Wat、Wam及肺组织中TGFβ1含量的变化

姜黄素组Wat及Wam与哮喘组相比明显减少，仍高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。同样，姜黄素组中TGFβ1含量较哮喘组明显降低，但与对照组相比仍有升高，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1、表1。

图1　免疫组化法检测大鼠肺组织中TGFβ1的表达（×400）

表1　大鼠Wat、Wam及肺组织TGFβ1含量的变化（±s）

表1　大鼠Wat、Wam及肺组织TGFβ1含量的变化（±s）

注：哮喘组、姜黄素组与对照组比较，▲▲P＜0.01；姜黄素组与哮喘组比较，△△P＜0.01。t1表示哮喘组与对照组比较，t2表示姜黄素组与哮喘组比较

组别　n 　W a t （μ m2/ μ m）　W a m （μ m2/ μ m）　T G F β 1对照组哮喘组姜黄组F 值P t 1 值t 2 值8 8 8 3 1 . 2 6 ± 1 . 4 6 6 8 . 0 2 ± 2 . 3 2▲▲4 5 . 7 5 ± 1 . 6 8▲▲△△4 7 2 . 2 4 ＜0 . 0 1 2 7 . 3 3 4 1 . 6 2 1 0 . 7 1 ± 1 . 0 4 2 9 . 4 4 ± 2 . 0 1▲▲1 6 . 6 4 ± 1 . 3 6▲▲△△1 6 1 . 5 1 ＜0 . 0 1 1 9 . 3 7 3 2 . 1 9 0 . 2 5 ± 0 . 0 1 0 . 5 1 ± 0 . 0 1▲▲0 . 4 4 ± 0 . 0 2▲▲△△2 1 7 . 2 3 ＜0 . 0 1 1 6 . 5 6 4 4 . 6 8

2.2姜黄素对哮喘大鼠ASMC的TGFβ1表达影响及增殖调控

与对照组比较，姜黄素组ASMC中TGFβ1mRNA表达及ASMC培养上清液中TGFβ1蛋白含量均明显减少，差异存在高度统计学意义（P＜0.01）。在细胞增殖检测中，姜黄素组ASMC增殖度较对照组明显受到抑制（P＜0.01）。见表2。

3　讨论

气道重塑是哮喘防治中最棘手的问题之一，其特征包括气道壁增厚、平滑肌增生、上皮下纤维化等［5，6］。TGFβ1具有调节多种细胞生长和分化等功能，在调控哮喘气道重塑中发挥重要作用，对气道壁增厚及纤维化的形成有直接影响［7，8］。

表2　姜黄素对ASMC中TGFβ1mRNA和蛋白表达的影响（±s）

表2　姜黄素对ASMC中TGFβ1mRNA和蛋白表达的影响（±s）

注：与对照组比较，▲▲P＜0.01

组别　T G F β 1 m R N A 　T G F β 1 （p g / m L）　A S M C对照组姜黄素组t值　P 1 0 0 . 0 0 ± 4 . 3 2 9 2 . 7 5 ± 5 . 1 2▲▲1 2 7 . 4 1 ＜0 . 0 1 9 6 . 7 6 ± 1 2 . 9 5 5 1 . 1 3 ± 1 0 . 9 6▲▲6 0 5 . 3 7 ＜0 . 0 1 1 0 0 . 0 0 ± 4 . 3 2 7 8 . 9 5 ± 5 . 1 2▲▲1 3 2 . 0 8 ＜0 . 0 1

TGFβ1是由112个氨基酸组成的双链多肽，其来源广泛。哮喘时气道炎症细胞（肺泡巨噬细胞、嗜酸性粒细胞）及气道结构细胞（上皮细胞、成纤维细胞及平滑肌细胞）均可表达TGFβ1。TGFβ1的遗传多态性与哮喘有关，严重的哮喘患者有更高的血清TGFβ1水平［9］。TGFβ1可以促进ASMC、成纤维细胞的增殖［10］，引起支气管下层增厚与胶原沉积，最终导致哮喘患者支气管狭窄。TGFβ1/Smad信号通路是哮喘气道重塑形成的一条重要信号通路，它参与调控细胞的增殖［11］、转化、合成、分泌和凋亡。在哮喘大鼠气道重塑中，TGFβ1、Smad2、Smad3表达增多，Smad6、Smad7表达减少，提示TGFβ1通过Smad通路参与哮喘气道重塑过程［12］。将TGFβ1加入大鼠气道平滑肌细胞培养液中，可以刺激平滑肌细胞增殖，其增殖作用通过阻断钙离子通道被部分抑制［13］。Lee等［14］证实，TGFβ1信号通路在哮喘大鼠气道重塑中发挥重要作用，通过调控TGFβ1的表达，可以改善气道重塑，尤其减少平滑肌厚度。

姜黄素是从姜黄属植物根茎中提取的一种植物多酚，也是姜黄发挥药理作用主要活性成分。姜黄素除了传统的作用外，还在抗炎、抗氧化、抗纤维化等方面均有显著作用［15，16］。因此，姜黄素成为防治许多炎症性疾病，尤其在呼吸系统疾病中作用的研究热点［17］。姜黄素降低哮喘小鼠BALF中炎症细胞百分比，减少嗜酸细胞浸润，改善小鼠气道炎症，减少黏液产生。姜黄素通过抑制α-平滑肌肌动蛋白或增强IFN-γ的表达，减轻哮喘炎症、延缓气道重塑。除抗炎作用外，姜黄素对细胞因子的调控作用也可以抑制细胞增殖、细胞间质的合成等作用。姜黄素抑制上皮增生、平滑肌层增厚，减少气道周围胶原纤维沉积，下调TGFβ1的表达。Gaedeke等［18］研究发现，姜黄素能抑制肾成纤维细胞TGFβ1及受体信号通路的表达，实现其抗纤维化作用。在博来霉素诱导的肺纤维化实验中，姜黄素可以减少TGFβ1的表达，抑制肺纤维化进展，且与糖皮质激素有相似的作用［19］。Hu Y等［20］研究发现，TGFβ1刺激HK-2细胞增殖的作用可以被姜黄素所抑制，其机制与下调TGFβ/Smad信号通路有关。然而，目前姜黄素对哮喘的研究主要停留在动物模型基础上。本实验通过姜黄素体内干预哮喘大鼠，发现大鼠Wat及Wam得到明显缓解，同时肺组织中TGFβ1含量降低，但未降至正常水平。课题组进一步通过体外培养ASMCs，发现姜黄素可以减少ASMC合成分泌TGFβ1，抑制ASMC的增殖程度。

综上所述，姜黄素可以减轻气道重塑，可能通过减少TGFβ1合成分泌以及抑制ASMC的增殖发挥作用，但其更深层次的调控机制尚有待进一步研究。

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▲通讯作者

［中图分类号］R285.5

［文献标识码］A

［文章编号］1673-9701（2016）19-0034-04

收稿日期：（2016-03-18）

［基金项目］浙江省温州市科技局科技计划项目（Y2013 0233）；浙江省自然科学基金（LY13H150005）

Effects of curcumin on the airway smooth musle cell by inhibiting TGFβ1 in asthmatic rats

YANG Nengli1LIANG Yafeng2LI Changchong3ZHANG Weixi3PAN Guoquan2
1.Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou325000，China；2.Department of Pediatric Intensive Care Unit，Yuying Children's Hospital，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou325000，China；3.Department of Children's Respiratory Disease，Yuying Children's Hospital，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou325000，China

［Abstract］Objective To study the role of curcumin on proliferation mechanism of airway smooth musle cell（ASMC）and TGFβ1 expression in asthmatic rats.Methods A total of 24 Sprague-Dawley（SD）rats were sensitized and challenged by OVA to establish asthmatic model were divided into three groups with 8 rats in each group.The total bronchial wall thickness（Wat）and the airway smooth musle thickness（Wam）were measured by image analysis system.The TGFβ1 expressions were determined by immunohistochemistry.Vitro experiments were conducted to determine the direct effect of curcumin on TGFβ1 expression by ASMC.Real-time PCR was employed to detect the expression of TGFβ1 mRNA levels.TGFβ1 concentrations were determined by sandwich enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.Cell Counting Kit-8（CCK-8）was used to detect ASMC proliferation.Results Wat and Wam of curcumin group were significantly thiner than asthma group（P＜0.01）；but those were significantly thicker than control group（P＜0.01）.The TGFβ1 expressions in the curcumin group was significantly lower than those of the asthmatic group（P＜0.01）；but they were higher than the control group（P＜0.01）.Compared to control group，curcumin decreased the protein expressions and mRNA expressions of TGFβ1 of ASMC（P＜0.01），inhibited ASMC proliferation（P＜0.01）.Conclusion Curcumin could inhibit ASMC proliferation in asthmatic rats，which is associated withthe decrease of TGFβ1.

［Key words］TGFβ1；Rat；Asthma；Airway remodeling；Curcumin