碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因分布

杨 朵，胡智颖，辛续丽

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因分布

杨 朵，胡智颖*，辛续丽*

目的 检测碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因分布情况，为此类菌感染的预防与控制提供理论依据。方法 改良Hodge试验检测医院临床分离肺炎克雷伯菌中碳青霉烯酶表型；PCR法检测KPC基因的携带率。结果 642株碳青霉烯类抗生素耐药的肺炎克雷伯菌中，Hodge 试验阳性率为96.6 %。KPC基因的携带率为50.9 %，均为KPC-2型。结论 该医院临床分离的碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌中KPC基因主要为KPC-2基因。

肺炎克雷伯菌； 碳青霉烯酶； KPC基因； Hodge试验

肺炎克雷伯菌是常见的医院感染病原菌，碳青霉烯类抗生素是治疗包括产ESBL在内肺炎克雷伯菌感染的重要抗菌药物。但近年来碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的出现，给临床感染控制提出了严重挑战。目前研究认为，对碳青霉烯类抗生素产生耐药机制主要包括细菌外膜蛋白通透性下降、产碳青霉烯酶等［1］，其中产碳青霉烯酶，特别是KPC型酶（Klebsiella pneumoniae carbapenemase，KPC）是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药的重要机制。我院从2009年首次检出碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，近年来此类菌已成为本院感染的重要致病菌，了解其对碳青霉烯类抗生素的耐药机制，了解KPC基因的分布情况，将有助于此类菌医院感染的有效控制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 642株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌分离自本院2011年1月-2013年12月临床标本（剔除同一患者的同一部位重复菌株）。

1.1.2质控菌株 Hodge试验阳性肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705，Hodge试验阴性肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706、大肠埃希菌ATCC 25922。产KPC-2阳性肺炎克雷伯菌为检验科自存。

1.1.3仪器与试剂 菌株鉴定采用经VITEK 2-Compact全自动细菌鉴定/药敏分析系统鉴定；PCR仪为美国AB公司Veriti型；所用培养基均为天津金章公司产品；亚胺培南及美罗培南等药敏纸片为英国OXOID公司产品；PCR通用试剂盒Easy-DoTMPCR PreMix、DNA分子量标准及引物均购自北京赛百盛基因技术有限公司。

1.2方法

1.2.1改良Hodge试验 依据CLSI 2011版推荐方法完成［2］。以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705为阳性对照，肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1706为阴性对照。

1.2.2细菌DNA模板制备 挑取10～15个新鲜菌落，加入pH8.0的ddH2O 100 μL，充分震荡混匀后沸水浴5 min，12 000 r/min 4 ℃离心10 min，留取上清液为DNA模板，-20 ℃保存。

1.2.3耐药基因检测 所有样本采用KPC通用基因引物进行检测，引物序列由本实验室设计，经本室自存KPC-2阳性肺炎克雷伯菌验证。 见表1。

表1　KPC基因引物序列Table 1 The primer sequences of KPC genes

PCR循环参数 95 ℃预变性2 min；94 ℃10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃ 30 s，30个循环；最后72 ℃延伸2 min。PCR产物电泳观察条带，阳性产物送上海生工生物工程公司测序，测序结果与NCBI网站（www.ncbi.nlm.nih.gov）进行BLAST比对，确认基因型。

2　结果

2.1改良Hodge试验结果

642株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，经改良Hodge试验检测后620株阳性，阳性率为96.6 %。

2.2PCR扩增检测结果

642株肺炎克雷伯菌中，KPC基因通用引物阳性327株，测序结果确认为KPC-2基因型，KPC-2基因检出率为50.9 %。部分KPC基因产物电泳图见图1。

3　讨论

肺炎克雷伯菌是最常见的医院感染病原菌，近年来，国内陆续报道出现碳青霉烯类抗生素耐药肺炎克雷伯菌［3］，由于碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌呈现多重耐药甚至泛耐药，导致此类感染临床治疗困难。了解本地区此类感染菌的主要耐药机制，将有助于控制该菌感染。

图1　部分KPC基因PCR产物电泳图Figure 1 Electrophoretic analysis of the PCR products of KPC gene in some strains

目前研究认为，细菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药的机制主要包括，产水解碳青霉烯酶如KPC酶；产染色体AmpC酶加外膜蛋白缺失或改变；青霉素结合蛋白（PBP）亲和力降低和主动外排系统增加等［2-3］。肺炎克雷伯菌等肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗生素耐药最主要的机制是产碳青霉烯酶，特别是KPC型酶［4-5］。KPC酶通常为质粒介导，能够水解包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类，这种活性可被β内酰胺酶抑制剂克拉维酸和他唑巴坦所抑制［6］。自1996年首次从美国加州的1株肺炎克雷伯菌中分离到KPC-1后，现已发现14种变异酶，在肺炎克雷伯菌中发现11种均具有碳青霉烯酶活性，它们相互之间有1～3个氨基酸的替换。目前报道的流行病学研究显示，美洲、欧洲、以色列、东亚等地流行的KPC酶型别主要为KPC-2［6］。我国在2007年首次报道在肺炎克雷伯菌中分离到KPC酶（KPC-2型），近年来也有流行的报道［7-8］。本研究结果发现，我院碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌中KPC-2型酶携带率为50.9 %，显示KPC-2酶确实在碳青霉烯类耐药的肺炎克雷伯菌中有较高流行。在碳青霉烯酶表型筛选中，本研究采用了CLSI推荐的Hodge试验方法。结果显示，Hodge试验的阳性率为96.6 %，KPC酶基因检测率为50.9 %，有293株Hodge试验阳性而未检测到KPC酶基因，其原因可能为：①产生其他类型的金属酶如VIM、IMP、SPM、GIM、SIM或携带有D型碳青霉烯酶如OXA系列等；②改良Hodge试验出现一定的假阳性，尤其是当菌株产生较多ESBL或AmpC酶时，可导致Hodge试验出现假弱阳性［9］。本试验菌株是否携带有其他类型的碳青霉烯酶还有待进一步研究确认。此外，全部642株菌均未检出NDM-1基因（NDM-1基因检测结果未在本文中显示），提示本研究中碳青霉烯类抗生素耐药机制与NDM-1无关。

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Prevalence of KPC gene in carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae isolates

YANG Duo，HU Zhiying，XIN Xuli. （Central Laboratory，Beijing Shijitan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100038，China）

Objective To investigate the prevalence of KPC gene in carbapenem-resistant K. pneumoniae isolates for better control of the relevant infections. Methods The carbapenemases were detected by Hodge test. KPC gene was tested by PCR. Results The results of Hodge test showed that 96.6 % of the 642 strains of carbapenem-resistant K. pneumoniae could produce carbapenemases. And 50.9 % of the isolates were positive for KPC-2 gene. Conclusions KPC-2 gene is the primary KPC gene in carbapenemresistant K. pneumoniae in this hospital.

Klebsiella pneumoniae； carbapenemase； KPC gene； Hodge test

R378

A

1009-7708（2016）04-0465-03

10.16718/j.1009-7708.2016.04.015

首都医科大学附属北京世纪坛医院中心实验室，北京 100038，*检验科。

杨朵（1970—），女，医学博士，副主任技师/副教授，主要从事细菌耐药机制、耐药菌分子流行病学、微生物检验诊断。

杨朵，E-mail：yangduo@bjmu.edu.cn。

2015-10-09

2015-12-07