金黄色葡萄球菌临床株对利奈唑胺耐药性及耐药机制

方 颍，黄永禄，蔡加昌，林晓伟，张 嵘，吕火烊

金黄色葡萄球菌临床株对利奈唑胺耐药性及耐药机制

方 颍1，黄永禄2，蔡加昌2，林晓伟3，张 嵘2，吕火烊3

目的 了解金黄色葡萄球菌（金葡菌）临床株对利奈唑胺耐药性及耐药机制。方法 收集2011-2014年浙江省人民医院900株金葡菌，采用纸片扩散法测定利奈唑胺药敏，对筛选到的耐药菌株采用琼脂稀释法测定常用药物的最低抑菌浓度（MIC），同时对其耐药基因cfr、optrA、23S rRNA基因第5功能区进行PCR扩增和序列分析。对cfr或optrA基因阳性的菌株进行基因周围序列分析和菌株多位点序列分型（MLST）。结果 临床分离金葡菌对利奈唑胺耐药率为0.1% （1/900），仅发现1株耐药株，该菌株为耐甲氧西林金葡菌（MRSA），对利奈唑胺MIC为8 mg/L、头孢西丁48 mg/L、青霉素32 mg/L、环丙沙星128 mg/L、克林霉素32 mg/L、氯霉素128 mg/L、万古霉素0.75 mg/L、替考拉宁0.5 mg/L。除万古霉素和替考拉宁，对其他抗菌药物均耐药。PCR结果显示该菌株cfr基因为阳性，optrA阴性，无23S rRNA突变。该菌株携带的cfr基因位于“Tn4001-like转座子-cfr-orf1-ISEnfa4”复合转座子中，并定位于一个39 504 bp的质粒上。该菌株的MLST分型为ST5。结论 临床分离金葡菌对利奈唑胺耐药率低，发现1株cfr基因介导的利奈唑胺耐药株，cfr基因位于质粒上一个常见的复合转座子中。

金黄色葡萄球菌； cfr基因； 利奈唑胺； 耐药

金黄色葡萄球菌（金葡菌）可引起皮肤和软组织感染、肺炎、感染性心内膜炎、骨关节感染、中枢神经系统感染、血流感染和中毒性休克等。上世纪40年代青霉素问世后有效地控制了葡萄球菌引起的感染，但是很快便出现青霉素耐药菌株。甲氧西林可用于治疗耐青霉素葡萄球菌的感染，然而临床应用2年之后便分离到甲氧西林耐药菌株。根据2013年CHINET细菌耐药性监测数据，耐甲氧西林金葡菌（MRSA）的比例为45.2 %，耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）的比例高达73.5 %［1］。利奈唑胺是首个唑烷酮类抗菌药物，于2000年在美国被批准用于临床，2007年进入中国市场，该药对大多数革兰阳性菌具有很强的抗菌作用，是治疗MRSA的一个重要选择。

利奈唑胺耐药的主要机制有细菌核糖体23S rRNA点突变、核糖体L3或L4蛋白的氨基酸突变以及耐药基因cfr［2］。最近，WANG等［3］报道在粪肠球菌和屎肠球菌中发现对利奈唑胺耐药的新基因optrA。cfr甲基转移酶可使23S rRNA的A2503位核苷酸发生甲基化，导致细菌对氯霉素、氟苯尼考、克林霉素和利奈唑胺等多种药物耐药［4-5］。近年来随着利奈唑胺的广泛应用，利奈唑胺耐药的葡萄球菌属在世界范围内流行［6］。2011年浙江大学医学院附属第二医院检测出16株凝固酶阴性葡萄球菌携带有cfr基因［7］。2013年，YANG等［8］报道杭州2所医院分离到9株cfr阳性的凝固酶阴性葡萄球菌。最近，CAI等［9］在国内发现了cfr基因导致的利奈唑胺耐药的MRSA。

本实验对浙江省人民医院的金葡菌进行筛选，并对其耐药机制进行了分析。

1　材料与方法

1.1菌株来源

收集2011-2014年浙江省人民医院临床分离的金葡菌900株。其中2011年188株，2012年312株，2013年200株，2014年200株。

1.2仪器与试剂

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪（matrix-assisted laser desorpt/ionionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）购自德国Bruker Dahonics公司；PCR扩增仪购自德国Biometra公司；DYY-1 1型水平电泳仪购自北京市六一仪器厂；脉冲场凝胶电泳仪及成像系统购自德国Biometra公司；引物合成自上海生工生物工程股份有限公司；Taq酶及PCR相关试剂购自日本TaKaRa公司。

1.3细菌鉴定

采用MALDI-TOF MS进行鉴定，具体操作步骤参见文献［10］。分别使用flexcontrol 3.3软件和MALDI Biotyper 3软件进行数据采集和结果分析。

1.4药敏试验

采用纸片扩散法对900株金葡菌进行利奈唑胺及头孢西丁药敏试验，药敏试验结果按CLSI M100-S24标准判断。采用肉汤稀释法测定头孢西丁、环丙沙星、克林霉素、氯霉素、利奈唑胺、万古霉素、青霉素、替考拉宁的最低抑菌浓度（MIC）。具体实验操作参照CLSI标准［11］。

1.5PCR检测

PCR扩增利奈唑胺耐药菌株的cfr、optrA、23S rRNA基因［3-4，12］和7个用于多位点序列分型（MLST）的管家基因。采用根据cfr阳性质粒设计的26对引物进行PCR扩增和序列分析（GenBank No.KJ922127）。

2　结果

2.1菌种鉴定

采用MALDI-TPF MS鉴定900株菌株，结果均为金葡菌。

2.2利奈唑胺耐药菌株筛选结果

采用纸片扩散法筛选到1株对利奈唑胺耐药的金葡菌，该菌株为MRSA。分离自感染科1例女性患者的呼吸道标本。临床诊断为吸入性肺炎，住院期间曾用过哌拉西林-他唑巴坦、异帕米星和氯康唑等抗菌药物，未使用过利奈唑胺。

2.3MIC测定

MIC结果显示，头孢西丁对该菌株的MIC为48 mg/L，为MRSA，利奈唑胺MIC为8 mg/L，为利奈唑胺耐药。青霉素为32 mg/L、环丙沙星为128 mg/L、克林霉素为32 mg/L、氯霉素为128 mg/L、万古霉素为0.75 mg/L、替考拉宁为0.5 mg/ L。除了万古霉素和替考拉宁，对其他抗菌药物均耐药。

2.4PCR扩增和序列分析

PCR扩增结果显示该株为cfr阳性，optrA阴性，无23S rRNA突变。MLST分型显示该菌株为ST5。

就26对引物的PCR产物进行序列拼接及分析，结果显示cfr基因位于质粒pLRSA417上。基因周围结构分析发现cfr基因位于“Tn4001-like转座子-cfr-orf 1-ISEnfa4”复合转座子中，见图1。

图1　复合转座子结构图Figure 1 The schematic structure of the Tn4001-like composite transposon

3　讨论

利奈唑胺耐药的机制有4种，其中cfr基因介导的利奈唑胺耐药引起越来越多的关注。本研究检出1株耐利奈唑胺的MRSA，实验结果显示该菌株为cfr阳性。2000年，SCHWARDS等［18］首先从牛体分离到1株松鼠葡萄球菌携带cfr基因并定位于16.5 kb的质粒（命名为pSCFS1）上，研究发现该基因可导致细菌对氯霉素和氟苯尼考同时耐药，但由于cfr表达出的蛋白与已知的介导氯霉素和氟苯尼考耐药的蛋白并无同源性，说明cfr是一种由新的耐药机制介导的耐药。后续研究表明，cfr基因是通过编码rRNA甲基转移酶使23S rRNA的A2503位核苷酸发生甲基化，并抑制C2498位的甲基化从而影响药物与细菌核糖体的结合导致耐药。2007年，TOH等［12］首次报道1株分离自临床患者的携带cfr基因的菌株—MRSA CM05，利奈唑胺对该菌的MIC值为16 mg/L，因未检测到其他导致利奈唑胺耐药的机制，通过研究发现cfr基因是导致其对利奈唑胺耐药的原因。在国内，2015年CAI等［9］报道了携带cfr基因的MRSA对利奈唑胺耐药，并对cfr基因所在质粒进行全质粒测序和分析，结果显示cfr基因位于一个39 504 bp的质粒上；TIAN等［19］在上海也分离到了cfr基因阳性耐利奈唑胺的金葡菌，说明cfr介导的利奈唑胺耐药正在逐渐重视。

目前临床患者来源的cfr基因，除了来自哥伦比亚的MRSA菌株CM05位于染色体，其他有关cfr基因的报道以质粒携带居多。本研究筛选到的菌株cfr基因定位于质粒pLRSA417上，大小为39 504 pb的质粒pLRSA417，该质粒首先报道自浙江大学医学院附属第二医院检测到的1株利奈唑胺耐药的金葡菌中［9］，对cfr周围序列分析得到cfr周围包括 Tn4001-like转座子，cfr、orf 1、ISEnfa4构成一个可移动元件。这个DNA片段跟WANG等［20］报道过的科氏葡萄球菌在结构上除了3个单核苷酸多态性和2个缺失外均相同，相似的结构在杭州分离的头状葡萄球菌、北京和瑞安分离的科氏葡萄球菌、美国分离的表皮葡萄球菌中也有报道［21-23］。说明这个结构可导致cfr基因有跨菌种的转移。

本次研究表明，目前中国cfr基因在金葡菌中携带率低（1/900），与之前报道的低携带率一致［24-25］。但cfr基因大多位于质粒上，可在不同种细菌或不同属细菌之间水平转移，导致耐药性在临床分离细菌之间、甚至动物来源细菌以及环境细菌之间相互传播，世界范围内的cfr基因传播需要引起警惕。

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Antibiotic resistance profile and mechanism of linezolid-resistant Staphylococcus aureus strains

FANG Ying，HUANG Yonglu，CAI Jiachang，LIN Xiaowei，ZHANG Rong，LÜ Huoyang. （Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Objective To investigate the linezolid resistance in clinical isolates of S. aureus and the underlying mechanisms. Methods A total of 900 S. aureus strains were isolated from Zhejiang Provincial People's Hospital during the period from 2011 to 2014. Linezolid-resistant strains were screened using disk diffusion method，and confirmed by minimal inhibitory concentration （MIC）determination. Resistance genes cfr，optrA，and the fifth functional region of 23S rRNA gene were identified by PCR amplification and sequencing analysis. The cfr or optrA positive strains were further characterized by surrounding sequence analysis and multilocus sequence typing （MLST）. Results The prevalence of linezolid-resistant isolates was 0.1% （1/900）. Only one strain was found resistant to linezolid，and also methicillin-resistant （MRSA）. The MIC value of linezolid，cefoxitin，penicillin，ciprofloxacin，clindamycin，chloramphenicol，vancomycin，teicoplanin against this strain was 8，48，32，128，32，128，0.75 and 0.5 mg/L，respectively. This isolate was susceptible to vancomycin and teicoplanin，but resistant to other antibiotics. PCR results indicated that cfr gene was positive，while optrA was negative in this strain. No 23S rRNA mutation was found. The cfr gene located in a composite transposon “Tn4001-like transposon-cfr-orf 1-ISEnfa4”，which was in a 39 504 bp plasmid. MLST showed that this isolate was ST5. Conclusions Linezolid resistance is very low in the clinical isolates of S. aureus in our hospital. Only one strain was positive for cfr gene，which is located in a common composite transposons in a plasmid.

Staphylococcus aureus； cfr gene； linezolid；antibiotic resistance

R378.11

A

1009-7708（2016）04-0477-04

10.16718/j.1009-7708.2016.04.018

浙江省医药卫生科技项目（2015112173）；浙江省自然科学基金（LQ13H200001）。

1. 浙江工业大学，杭州 310014；2. 浙江大学医学院附属第二医院检验科；3. 浙江省人民医院检验科。

方颍 （1992—），女，硕士研究生，主要从事细菌检验工作。

张嵘，E-mail：brigitte_zx@163.com。

2015-07-31

2015-08-19