采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速检测产KPC大肠埃希菌ST131和ST405分型的研究

黄永禄，李佳萍，顾丹霞，林晓伟，吕火烊，张 嵘

采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱快速检测产KPC大肠埃希菌ST131和ST405分型的研究

黄永禄1，李佳萍1，顾丹霞2，林晓伟2，吕火烊2，张 嵘1

目的 采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）快速检测产KPC大肠埃希菌ST131、ST405，并对该方法的可行性进行评价。方法 收集浙江省人民医院临床分离46株大肠埃希菌，扩增blaKPC耐药基因，采用多位点序列分型方法（MLST）进行分型。MALDI-TOF MS对大肠埃希菌进行鉴定并对不同克隆的峰图进行主成分分析和算法统计，获得分型区分的特征峰。结果 46株KPC型大肠埃希菌均携带KPC-2耐药基因，MLST方法检测到2种ST型，分别为ST131和ST405。主成分分析图显示ST131和ST405可分为2簇，其中2株ST131和3株ST405分类错误。ClinProTools软件4种算法结果基本相似，方法特异度和灵敏度分别为93.27 %和97.92 %。用于区分ST131和ST405的特征峰主要为8 331.84、4 166.44、4 860.21和2 783.66 Da。这4个峰区分具有统计学意义，有较高准确性。结论 采用MALDI-TOF MS可快速区分产KPC大肠埃希菌ST131和ST405，具有操作简单、耗时短、区分灵敏度和特异度高以及成本低等优点，能用于大肠埃希菌克隆分型研究。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱； 大肠埃希菌； 多位点序列分型； 质谱分型； ST131； ST405

大肠埃希菌是社区和医院感染的主要病原体，在2013年CHINET临床分离菌株中排名第一，检出率达19.86 %。自2008年中国杭州首次发现耐碳青霉烯大肠埃希菌后［1］，世界各地均有报道［2-5］，且发生率逐年增加。快速可靠地分辨耐碳青霉烯类大肠埃希菌不同克隆型对其传播和流行病学监测至关重要。目前，分型方法包括扩增片段长度多态性分析（AFLP）、随机扩增多态性DNA分析（RAPD）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）以及多位点序列分析（MLST）等［6］。由于MLST具有重复性强、分辨率较高、所得数据可在全球范围内进行交流的优点，成为目前分型最常用的方法［7-8］，但该方法需要扩增大肠埃希菌7对管家基因并进行测序比对，存在实验操作繁琐、耗时长、成本高等缺点［6］。

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDITOF MS）除了在细菌鉴定上有强大优势以外［9-10］，用于细菌耐药和快速分型的研究也受到越来越多的关注，可用于快速鉴别耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（金葡菌）［11-12］，检测耐碳青霉烯酶肠杆菌科细菌［13-14］，在快速分型上的应用包括金葡菌CC分型［15］，大肠埃希菌O157：H7的特征峰研究等。本实验采用MALDI-TOF MS对大肠埃希菌进行快速分型，以期判断质谱用于快速分型的可靠性。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株来源 46株大肠埃希菌临床分离株收集自2011-2014年浙江省人民医院，主要分离自尿液、痰液和分泌物标本。

1.1.2试剂和仪器 三氟乙酸（TFA）、α-氰-4-羟基苯丙烯酸（CHCA）、色谱级乙腈、甲酸、无水乙醇（美国Sigma公司）。哥伦比亚血琼脂平皿（杭州威晟生物科技公司）。Microflex LT MACDI-TOF MS仪（德国Bruker公司）。MALDI-TOF MS基质（50 %乙腈加2.5 %三氟乙酸配制的饱和α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液）实验室配制。

1.1.3统计软件 FlexControl 3.0软件，Biotype 3.0软件，ChinProTool 3.0软件（德国Bruker公司）。

1.2方法

1.2.1菌株培养和鉴定 将分离菌株转种于哥伦比亚血平皿上，35 ℃孵育18～24 h，采用蛋白提取法处理后，采用MALDI-TOF MS进行鉴定，重复3次。大肠埃希菌DH5α蛋白提取液作为校准品，测定时用于仪器的校准和阳性对照，具体步骤参照文献［12］，使用FlexControl 3.0软件采集质谱图数据，图谱数据比对使用Biotyper 3.0软件与标准数据库进行比对，使用分值量化来判定结果，得分大于2.0可鉴定到种的水平，得分小于2.0而大于1.7可鉴定到属的水平，得分小于1.7则表示无法给出可靠的鉴定结果。

1.2.2碳青霉烯类耐药基因检测 对大肠埃希菌碳青霉烯酶基因blaKPC进行扩增［16］，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析，扩增产物送上海生工生物技术有限公司测序，测序结果与GenBank上已知序列进行比对分析。

1.2.3MLST PCR分别扩增大肠埃希菌的7个管家基因（adk，fumC，gyrB，icd，mdh，purA，recA），引物序列和PCR扩增条件参照文献［16］。PCR产物经测序后所得DNA序列与数据库（http：// pubmlst.org）进行比对，确定序列类型（ST型）。

1.2.4算法分析 采用Biotyper 3.0软件将对比数据进行主成分分析，生成主成分分析（PCA）图。采用ChinProTool 3.0软件对各菌株峰图进行分组分析，实验步骤按照软件自带说明书操作。维持基本参数不变，将所有菌株分为2组（ST131组和ST405组），分别调入样品数据，采用遗传算法（GA）、支持向量机算法（SVM）、监督神经网络算法（SNN）和快速分类算法（QC）对数据进行分析并建立相应模型。模型中识别能力（recongnition capability）和交叉验证（cross validation）分别体现了该模型的灵敏度和特异度，对区分这2组的特征性峰进行图谱差异比较及分析，判断质谱能否用于大肠埃希菌分型。

2　结果

2.1微生物鉴定、耐药基因扩增、MLST分型

MALDI-TOF MS 鉴定结果均为大肠埃希菌，得分均＞2.000，准确鉴定到种。46株大肠埃希菌均产KPC-2型碳青霉烯酶。46株KPC-2型大肠埃希菌中22株为ST131，24株为ST405。

2.2数据分析

2.2.1主成分分析 主成分分析显示46株产KPC型大肠埃希菌大致分为两簇，ST131（红色）和ST405（绿色和蓝色），其中2株ST131（编号为编号1，22）和3株ST405（编号为38，41，43）分类错误。见图1。

2.2.2ClinProTools软件算法统计 通过GA、SVM、SNN和QC 4种算法的结果基本相似，其灵敏度均＞90.00 %，其中GA算法得出的灵敏度最高为100 %，其次为SVM算法97.92 %，SNN算法95.83 %，QC算法的灵敏度相对较低，为93.75 %；特异度SVM算法最高93.27 %，GA算法90.64 %，其余2种算法的特异度一致，均为88.91 %，SVM算法是MALDI-TOF MS用于大肠埃希菌分型分析最合适算法。

2.2.3特征性峰数据统计 采用ClinProTools对质谱峰进行统计显示，峰104、42、57和18是用于区分ST131和ST405最为主要的特征性峰，图2直观显示两组菌株平均峰图的主要特征峰差异，主要特征峰分别在8 331.84、4 166.44、4 860.21 和2 783.66 Da处。

图1　ST131（红色）和ST405（绿色和蓝色）主成分分析图Figure 1 Principal component analysis dendrogram of ST 131 （red） and ST405 （green and blue）

图2　ST131（红色）和ST405（绿色）特征峰比较图Figure 2 Representative peaks of the average spectra of the ST131 （red） versus ST405 isolates （green）. arb. u.，arbitrary units

Anderson-Darling检验是正态性检验的一种方法，可确定样本所基于的总体是否呈非正态分布的单样本假设检验。其P值越接近0，则总体呈非正态性分布。这4个特征性峰的Anderson-Darling检验的P值（PAD）均＜0.05，见表1，这些峰呈非正态性分布，从而选用秩和检验的P值（PWKW）来衡量这些特征性峰用于区分ST131和ST405组差异有无统计学意义。结果显示，这4个峰的PWKW值均＜0.05，说明两组菌株之间的这4个峰的差异有统计学意义。受试者工作特征曲线（ROC曲线）可以反映各个峰鉴别ST131和ST405组的灵敏度和特异度，ROC曲线绘制图显示，这4个特征性峰的曲线下面积（AUC）均＞0.9，提示这些峰在鉴别ST131和ST405菌株时有较高准确性。

表1　区分ST131和ST405特征性峰的峰值统计数据Table 1 Data of the characteristic peaks which were used to distinguish ST131 from ST405

3　讨论

2008年，杭州地区首次发现产KPC大肠埃希菌［1］。2014年，MLST结果显示杭州地区KPC-2大肠埃希菌主要ST型为ST131［17］，还包括ST648、ST38、ST405等，与国际上关于产KPC大肠埃希菌的ST型报道一致［18-19］。ST131和ST405大肠埃希菌与高水平耐药相关，其中ST131是全球流行的多重耐药克隆大肠埃希菌的主要ST型，易携带耐药基因在不同菌株之间流行传播；ST405是产KPC大肠埃希菌的另一种主要ST型，通常携带不同的CTX-M型耐药基因，且与很多毒力因子相关，目前证实已经是高风险的流行克隆株［20］。MLST作为目前最常用分型方法，可用于细菌毒力株和耐药株的追踪，新的变异株引起的疾病流行鉴定与分子流行病学研究。MLST通过分析基因的核苷酸序列，构建系统发育图，能推断菌株间的系统发育关系，解决了多位点酶凝胶电泳（MLEE）等技术分析基因表达产物的缺陷，也解决了PFGE在各实验室相互比较困难的问题［6］。但它同样具有局限性：MLST不适用于管家基因变异程度低或无变异的菌株；操作繁琐，需要扩增7对管家基因并进行测序，耗时长，成本过高；对于分析含有大量基因组岛、插入序列或缺少基因组详细信息的菌株存在局限性。

已有报道认为，MALDI-TOF MS用于分型研究具有强大潜力，对于常见人类致病菌如肺炎链球菌［21］，质谱得到肺炎链球菌区分其他链球菌的特征峰是2 944 Da，可直接应用于临床感染的判断；质谱显示金葡菌CC分型中存在特征峰可以快速区分不同CC分型［15］。但质谱用于分型研究中也同样存在一些问题，如质谱能快速区分沙门菌属具体种但无法区分临床相关血清型［22］。SPINALI等［23］认为，质谱在分型研究上还缺少系统的方法和指导原则，尤其是质谱十分灵敏，培养条件以及操作条件都可能影响质谱稳定性。2014年，MATSUMURA等［24］研究了产ESBL大肠埃希菌ST131和ST405 区分的特征峰是9 720 Da，两者区分灵敏度和特异度分别为94.0 %和92.7 %；而2015年，LAFOLIE等［25］对ST131大肠埃希菌与其他ST型区分，发现在9 713 Da和6 612 Da有其特征峰。本次实验对产KPC大肠埃希菌ST131 和ST405进行区分得到的特征峰和文献报道存在差异，可能的原因：①细菌培养基的选择以及细菌的培养条件，这些因素可能会影响质谱的峰图［26］；②细菌存在不同的耐药和毒力基因，会导致质谱图谱存在差异，这也可能是主成分分析图中存在5株细菌分类错误的原因。

编码碳青霉烯酶的基因多由质粒介导，耐药基因随质粒转移在不同菌种之间传播，造成耐药性的扩散，快速可靠地鉴定并分辨细菌分型对细菌传播研究和大规模流行病学监测至关重要。本研究中，ClinProTools软件对ST131和ST405两组进行分析得到3 239、4 166、4 860和8 332 Da是用于区分的最主要的4个特征性峰，这些峰的秩和检验的P值均＜0.05，同时ROC曲线的AUC均＞0.9，说明这4个峰区分ST131和ST405有统计学意义，在鉴别ST131和ST405菌株时有较高准确性。综上所述，在本次研究中，采用MALDI-TOF MS对产KPC大肠埃希菌主要ST型ST131和ST405能够快速区分，与MLST方法相比，具有操作简单、耗时短、灵敏度和特异度高、成本低等优点，质谱技术在细菌同源性分析上具有巨大潜力。

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Matrix-assisted laser desorption ionization - time of flight mass spectrometry for rapid typing of KPC-producing Escherichia coli ST131 and ST405

HUANG Yonglu，LI Jiaping，GU Danxia，LIN Xiaowei，LÜ Huoyang，ZHANG Rong. （Clinical Laboratory Center，the Second Affiliated Hospital of Zhejiang University，Hangzhou 310009，China）

Objective To rapidly identify and detect KPC-producing Escherichia coli ST131 and ST405 groups by matrix-assisted laser desorption ionization - time of flight mass spectrometry （MALDI-TOF MS） method. Methods Forty-six E.coli isolates were collected from Zhejiang Provincial People’s Hospital. The blaKPCgene was amplified and multilocus sequence typing （MLST） was performed to analyze the molecular typing of these strains. All the strains were identified by using MALDI-TOF MS method. The resulting mass spectra were analyzed by principal component analysis and algorithm statistics to obtain the characteristic peaks. Results All the 46 E. coli isolates carried KPC-2 resistant gene. MLST showed two clonal groups of E. coli，ST131 and ST405. Principal component analysis diagram indicated the ST131 and ST405 groups were divided into two clusters，but two ST131 and three ST405 isolates were misclassified. The four standard algorithms in ClinProTools provided similar results in differentiating ST131 from ST405 isolates. The sensitivity and specificity were 93.27 % and 97.92 %，respectively. Four main characteristic peaks were 8 331.84，4 166.44，4 860.21 and 2 783.66 Da，which had statistical significance and high accuracy in differentiating the strains. Conclusions MALDI-TOF MS method has shown good performance in differentiating ST131 from ST405 clonal groups. It is simple to operate at low cost and short time with high sensitivity and specificity.

matrix-assisted laser desorption ionization - time of flight mass spectrometry； Escherichia coli； multilocussequence typing； mass spectra typing； ST131； ST405

R378.1

A

1009-7708（2016）04-0460-05

10.16718/j.1009-7708.2016.04.014

浙江省中医药管理局资助项目（2011ZA058）；浙江省科学技术厅2014年度省公益性技术应用研究计划项目（2014C33191）；浙江省科技厅公共卫生监测与突发事件处置关键技术研究科技创新团队项目（2011R50021）。

1. 浙江大学附属第二医院检验科，杭州 310009；2. 浙江省人民医院。

黄永禄（1972—），男，硕士，主管技师，主要从事免疫方面研究。

张嵘，E-mail：brigitte_zx@163.com。

2015-09-17

2015-12-14