Card9在急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织中的表达及其意义

王海　杨志文　孟潇潇　徐萍



·短篇论著·

Card9在急性坏死性胰腺炎大鼠胰腺组织中的表达及其意义

王海杨志文孟潇潇徐萍

急性胰腺炎(AP)的发病机制仍未完全阐明，其中“炎症因子学说”[1]认为，巨噬细胞激活后释放大量细胞因子，造成组织损伤加重，进而发展为全身炎症反应。Card9是巨噬细胞高表达的一种新型蛋白，它作为NF-κB、p38MAPK炎症信号通路的上游分子，能促进巨噬细胞产生、释放炎症因子，并在体外巨噬细胞炎性激活中起至关重要的作用[2]。本课题组前期临床结果显示，早期AP患者胰腺组织Card9 mRNA及蛋白表达显著增加，且与胰腺炎严重程度相关[3]。本研究检测急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠胰腺组织Card9表达，探讨其作用机制。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：84只健康雄性SD大鼠，鼠龄2～2.5个月，清洁级，体重160～200 g，由上海交通大学附属上海市第一人民医院提供和饲养，动物合格证号：SYXK(沪)2009-0086。实验前12 h禁食，自由饮水。按随机表法分成正常组(12只)、假手术组(36只)、ANP组(36只)。采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠1 ml/kg体重方法制作ANP模型。假手术组开腹后翻动胰腺并以钝器轻划胰腺3次后关腹。制模后3、6、12 h分批处死大鼠，经腹主动脉采血5 ml，注入促凝管中静置1 h，以3 000 r/min低温离心10 min分离血清，置液氮保存备用；观察胰腺大体病理变化后切取部分胰腺组织置液氮保存，部分胰腺组织用10%甲醛液固定过夜。正常组大鼠开腹后直接抽血、取胰腺组织。

2．检测指标：(1)血清淀粉酶测定：由松江中心医院检验科自动生化分析仪进行测定。(2)胰腺组织病理检查：固定胰腺组织常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察组织病理改变，并采用Schimidt等[4]标准从水肿、炎症细胞浸润、出血和脂肪坏死程度4个方面进行评分，4个评分相加为总评分。(3)血清TNF-α、IL-1β检测：采用酶联免疫吸附法检测，试剂盒由eBioscience公司提供。(4)Card9 mRNA表达检测：采用实时RT-PCR法检测。Card9上游引物5′-TCTTTCGCAGACCCATGACA-3′，下游引物5′-GTCGTATTCCCGTGATCCCC-3′，扩增产物159 bp；内参GAPDH上游引物5′-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，下游引物5′-TCCCATTCTCAGCCTTGAC-3′，扩增产物187 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成。取100 mg液氮固定的胰腺组织，加入1 ml Trizol抽提组织总RNA，逆转录合成cDNA，行PCR扩增。PCR反应条件：95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s，40个循环。由PCR仪自带软件获取Ct值，ΔCt值=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtANP组-ΔCt正常组，采用公式2-ΔΔCt计算mRNA的表达量。

二、结果

1．血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平变化：ANP组大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平随造模后时间延长而逐渐升高，较同时点假手术组大鼠均显著升高，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表1)。假手术组血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平与正常组的差异无统计学意义。

表1　各组大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平变化

注：与同时点假手术组比较，aP<0.05

2．胰腺组织病理改变：正常组大鼠胰腺组织结构完整，未见间质充血、出血和腺泡细胞坏死；假手术组大鼠胰腺组织结构清晰，绝大部分腺泡小叶完整，偶见炎性细胞和红细胞浸润，未见腺泡细胞坏死；ANP组大鼠胰腺组织可见腺泡细胞变性、坏死，小叶结构破坏、间隔增大，细胞间隙水肿，红细胞和炎性细胞浸润，并随着时间延长而加重(图1)。正常组，假手术3、6、12 h组，ANP 3、6、12 h组大鼠胰腺组织病理评分分别为(0.65±0.50)、(1.10±0.50)、(1.50±0.85)、(2.00±0.68)、(9.15±1.95)、(11.71.1.01)、(3.35±2.25)分。ANP组较同时点假手术组均显著增高，差异有统计学意义(P值均<0.05)，而假手术组与正常组的差异无统计学意义。

图1　正常组(1A)、假手术组(1B)、ANP 6 h组(1C)大鼠胰腺组织的病理改变(HE　×400)

3．胰腺组织 Card9 mRNA表达变化：正常组，假手术3、6、12 h组，ANP 3、6、12 h组大鼠胰腺组织Card9 mRNA表达量分别为1.0、2.03±0.89、2.50±0.60、4.17±3.54、7.71±4.34、13.35±2.66、23.72±7.67。ANP组较同时点假手术组均显著增高，差异有统计学意义(P值均<0.05)，而假手术组与正常组的差异有无统计学意义。

4．胰腺Card9 mRNA表达量与胰腺病理评分及血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平的相关性：ANP 6、12 h组大鼠胰腺组织Card9 mRNA表达量与同时间点的胰腺组织病理评分及血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平均呈正相关(6 h时r值分别为0.898、0.817、0.862、0.721；12 h时r值分别为0.679、0.849、0.759、0.728，P值均<0.05，图2、3)。

图2ANP 6 h组胰腺Card9 mRNA表达量与血清淀粉酶(2A)、胰腺病理评分(2B)、血清TNF-α(2C)、IL-1β水平(2D)的相关性

图3ANP组12 h时胰腺Card9 mRNA表达量与血清淀粉酶(3A)、胰腺病理评分(3B)、血清TNF-α(3C)、IL-1β水平(3D)的相关性

讨论目前已有文献[5-7]证实，Card9在肺结核、膀胱炎、关节炎等感染性疾病发病机制中均发挥重要作用； PPARγ激动剂能够下调巨噬细胞Card9蛋白表达，从而抑制炎症信号通路的激活，减少炎症因子分泌[8]。但Card9与AP发病机制之间的联系尚未完全阐明。本研究结果显示，ANP组大鼠血清淀粉酶水平、胰腺病理损伤及血清TNF-α、IL-1β水平均迅速升高，且随时间的延长逐渐增加；同时，胰腺组织Card9 mRNA表达量也随时间的延长而逐渐增加，且与血清淀粉酶、胰腺组织病理评分、血清TNF-α和IL-1β的水平均呈正相关，表明胰腺组织Card9 mRNA表达能促进TNF-α、IL-1β的分泌，从而加重胰腺炎症反应，与胰腺炎轻重程度成正相关[9]。

[1]Perides G, Wesis ER, Michael ES, et al. TNF-alpha-dependent regulation of acute pancreatitis severity by Ly-6C(hi) monocytes in mice[J]. J Biol Chem, 2011, 286(15):13327-13335.

[2]Roth S，Ruland J．Caspase recruitment domain-containing protein 9 signaling in innate immunity and inflammation[J]．Trends Immunol，2013，34(6)：243-250.

[3]翁成钊，徐萍，杨志文，等．急性胰腺炎早期胱天蛋白酶募集域蛋白9的动态变化及其临床意义[J]．中华消化杂志，2015，35(1)：54-56.DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-1432.2015,01.021.

[4]Schimidt J, Rattner DW, Lewandrowski K, et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy[J]. Ann Surg, 1992, 215(1):44-56.

[5]Dejima T, Shibata K, Yamada H, et al. A C-type lectin receptor pathway is responsible for the pathogenesis of acute cyclophosphamide-induced cystitis in mice[J]. Microbiol Immunol, 2013, 57(12):833-841.

[6]Hsu YM, Zhang Y, You Y, et al. The adaptor protein CARD9 is required for innate immune responses to intracellular pathogens[J].Nat Immunol,2007,8(2)198-205.

[7]Nemeth T, Futosi K, Weisinger J, et al. Card9 mediates autoantibody-induced autoimmune diseases by linking the Syk tyrosine kinase to chemokine production[J]. Annrheumdis, 2013,205124.199.

[8]Kock G, Bringmann A, Held SA, et al. Regulation of dectin-1-mediated dendritic cell activation by peroxisome proliferator-activated receptor-gamma ligand troglitazone[J]. Blood, 2011, 117(13):3569-3574.

[9]Malleo G, Mazzon E, Siriwardena AK, et al. Role of tumor necrosis factor-alpha in acute pancreatitis: from biological basis to clinical evidence[J]. Shock,2007,28(2):130-140.

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2016.01.017

国家自然科学基金课题(81370569)

201600上海，南京医科大学附属上海松江中心医院

徐萍，Email: sjzxxp@yeah.net

2015-07-28)