缺血预处理对大鼠缺血再灌注后心房肌Cx43和Cx40的影响

韩劲松 历志 王辉山 尹宗涛 薛晓东

基础研究

缺血预处理对大鼠缺血再灌注后心房肌Cx43和Cx40的影响

韩劲松 历志 王辉山 尹宗涛 薛晓东

目的 探讨缺血预处理（IPC）对大鼠缺血再灌注（I/R）后心房肌缝隙连接蛋白43（Cx43）和缝隙连接蛋白40（Cx40）表达和分布的影响。方法 30只Wistar大鼠随机分为假手术组（或对照组，n=5）：只穿线不结扎左冠状动脉前降支；缺血再灌注组（I/R组，n=5）：给予前降支结扎30 min，再灌注120 min；早期缺血预处理组（IPC组，n=5）：行IPC处理后，余处理同I/R组；延迟IPC组（L-IPC组，n=5）：在IPC处理24 h后，余处理同I/R组；早期远程缺血预处理组（RIPC组，n=5）：给予RIPC后，余处理同I/R组；延迟RIPC组（L-RIPC组，n=5）：RIPC处理24 h后，余处理同I/R组。测量心房组织Cx40、Cx43的mRNA表达，Cx40、Cx43蛋白表达，以及用免疫组化法测定Cx40、Cx43的分布。结果 I/R组Cx43和Cx40在mRNA水平和蛋白水平均明显降低，分布无规律且侧面分布相对增加。而各种IPC方式（IPC、L-IPC、RIPC、L-RIPC）在I/R后，心房Cx43和Cx40 mRNA水平和蛋白水平下降不明显，其分布多于心肌细胞闰盘处，仅少量分布于心肌细胞侧面。结论 IPC能维持I/R后心房肌Cx43和Cx40的较高表达，并维持其空间分布相对稳定。

缺血预处理； 缝隙连接蛋白； 心房； 心律失常

缺血预处理（IPC）是目前所知的最强大的内源性心肌保护机制。远程预处理（RIPC）是另一种形式的IPC。最近研究表明，IPC和RIPC可能降低心房颤动的发生率[1-3]。心房颤动是临床上常见的心律失常，目前正呈现全球性爆发的趋势[4]。缝隙连接蛋白 43（Cx43）和缝隙连接蛋白 40（Cx40）与心房颤动的发生关系密切[5,6]。本研究拟通过研究系列IPC和RIPC方法对大鼠心房肌Cx43和Cx40表达和分布的影响，探寻一种非药物干预心房肌的方法，为进一步干预心房颤动提供一定的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物模型的制备 体重200 g的Wistar大鼠，麻醉后接呼吸机，接心电图肢体导联。逐层钝性分离肌肉，沿胸骨左缘0.5 cm剪断2～4肋骨，用线牵拉两侧肋骨暴露胸腔。剪破心包，暴露肺动脉圆锥与左心耳之间的左冠状静脉。以其为标志,在左冠状静脉下缝线，线两端共穿一根聚乙烯小管以形成闭环。拉紧闭环并用止血钳固定造成心肌缺血，放松闭环使线放松后即行再灌注。以左室前壁发绀或呈蓝紫色及同步心电图ST段抬高为结扎成功标志。IPC方法：手术穿线平衡10 min后，缺血5 min，再灌注5 min，反复4次。RIPC方法：以止血带捆绑双下肢阻断血流5 min，放松5 min，反复4次。每次捆绑以观察到双下肢皮色变紫及超声多普勒在捆绑下方听不到动脉波动为准。

1.2 试剂及仪器 动物组织总RNA提取试剂盒（DP431），天根生化科技（北京）有限公司；One Step SYBRRPrimeScriptTMRT-PCR KitⅡ（Perfect Real Time）为Takara公司产品；引物序列由沈阳博洋生物技术有限公司合成。总蛋白提取试剂盒（Vazyme）、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、4XSDS-PAGE分离胶缓冲液、10×电泳转移缓冲液、5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液、6×蛋白上样缓冲液（含β-巯基乙醇）、预染次高分子量蛋白 Marker为北京索莱宝科技有限公司产品；ECL化学发光检测试剂盒，货号32109，Invitrogen公司产品。Thermal Cycler Dice Real Time System Single（荧光定量 PCR 仪），TP850，Takara；Allegra 25R 台式高速冷冻离心机，美国Beckman（贝克曼）公司；Micro 17R微量台式离心机，美国Thermo（赛默）公司；微量可调移液器，德国Eppendorf公司；低温高速离心机，型号3-18K，德国SIGMA公司产品；电泳仪、Mini-PROTEAN Tetra MP4电泳槽、785型真空转印仪、凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司产品；IKA T10高速组织匀浆机为德国IKA/艾卡公司产品；酶标仪ECL800为美国宝特公司产品；水平摇床IS系列美国精骐产品；切片机（LEICA RM 2145）/冷台（LEICA EG 1150C）/摊片机（LEICA HI 1220）/烤片机（LEICA HI 1210）。

1.3 实验动物分组 30只大鼠分为6组，每组5只。假手术组（或对照组）只穿线不结扎左冠状动脉前降支；缺血再灌注组（I/R组）前降支结扎30 min，再灌注120 min；早期缺血预处理组（IPC组）行IPC处理后，余处理同I/R组；延迟IPC组（L-IPC组）在IPC处理24 h后，余处理同I/R组；早期远程缺血预处理组（RIPC组）给予RIPC后，余处理同I/R组；延迟RIPC组（L-RIPC组）RIPC处理24 h后，余处理同I/R组。实验结点完毕，取左、右心房肌组织保存待查。

1.4 指标测定

1.4.1 Real-time PCR方法检测心房组织Cx40、Cx43的mRNA表达 根据Gen Bank中报道的基因序列，应用DNASTAR软件设计引物，采用Trizol法提取RNA，反转录至cDNA，用Syber Green荧光定量PCR检测试剂盒配伍反应体系，放置荧光定量PCR仪中，设置PCR热循环参数：95℃ 2 min，95℃ 30 s，60℃ 30 s收集荧光信号，40个循环，结果采用2-ΔΔCT法计算mRNA的相对表达量。

1.4.2 Western-blot方法检测心房组织Cx40、Cx43蛋白表达 分离缺血的心房肌组织，用PBS液（预冷）进行洗涤，称取100 mg放在液氮中研磨为粉末，4℃裂解，12 000 rpm 4℃ 离心30 min，取上清，-20℃冻存备用。采用BCA蛋白定量试剂盒完成心肌组织蛋白定量。分别取待测蛋白样品50 μg完成SDS-PAGE，转到NC膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入相应稀释的Cx40、Cx43抗体，4℃孵育过夜，PBST洗涤后加入稀释的二抗室温孵育1 h，洗涤沥干后加入ECL Plus试剂进行ECL显影。最后用图像分析软件测定图片上每个特异性条带灰度值。

1.4.3 免疫组化法（SP法）测定Cx40、Cx43分布将石蜡切片脱蜡水化，组织抗原微波修复（置0.01 M枸橼酸缓冲液，pH=6.0，煮沸 95 ℃，15～20 min）；滴加一抗，置湿盒中37℃温箱孵育20 min；上述步骤之间均以磷酸盐缓冲液（pH=7.4）洗片3次，DAB显色，苏木素复染；脱水，中性树脂封片。取已知含有待检抗原的切片经上述步骤染色，作为阳性对照。用磷酸盐缓冲液代替第一抗体经上述步骤染色，作为阴性对照。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件分析。计量资料以±s表示，使用方差结合post-Hoc检验，不同时间点应用重复方差检验。计数资料用率表示，组间比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心房组织Cx43、Cx40的mRNA表达 与其他组比较，I/R组在左心房和右心房中mRNA表达最低（P＜0.05），IPC 组、L-IPC 组、RIPC 组和 L-RIPC组与对照组比较，未见明显降低（P＞0.05）。见图1。

2.2 心房组织Cx43、Cx40蛋白表达 与其他组比较，I/R组在左心房和右心房中mRNA表达最低（P＜0.05），IPC 组、L-IPC 组、RIPC 组和 L-RIPC 组与对照组比较，未见明显降低（P＞0.05）。见图2。

2.3 Cx43、Cx40的分布 对照组：线性规律分布于心肌细胞闰盘处，仅少量分布于心肌细胞侧面。I/R组：分布无规律且侧面分布相对增加。IPC组、LIPC组、RIPC组和L-RIPC组与对照组类似，仅少量分布于心肌细胞侧面。

图1 心房组织Cx43、Cx40的mRNA表达

图2 心房组织Cx43、Cx40蛋白表达

3 讨论

IPC对心肌保护作用呈双相过程，包括即刻出现的早期保护（早期预处理或经典预处理）和IPC后24 h出现的延迟保护（又称第二保护窗口或延迟预处理，即L-IPC），前者一般持续1～3 h，后者可持续数天。心外组织如肾脏、小肠及骨骼肌短暂缺血不仅能减轻局部组织的再灌注损伤，对心脏也有保护作用，并将这种现象称为RIPC。IPC和RIPC对心肌的保护作用已被广泛接受，但均是针对心室肌的研究，对心房肌的影响尚不清楚。本研究结果初步提示，各种IPC方式包括经典IPC、L-IPC、RIPC和L-RIPC均对缺血再灌注后心房肌的Cx43和Cx40的表达及分布产生了影响，即维持Cx43和Cx40相对高表达，并维持其空间分布相对稳定。

缝隙连接结构是介导相邻细胞间电耦连的一种通讯连接方式，是实现心肌细胞之间电和化学信息交换的重要结构。研究[5]发现，缝隙连接组成了心肌细胞之间的低电阻通路，成为心脏电传导的主要决定因素。连接蛋白表达水平的改变、更新、重新分布及结构异常是引起心律失常的重要解剖学基础。缝隙连接通道的重新分布和密度改变会导致相应传导速度和各向异性传导发生改变，产生传导减慢和单向阻滞，从而形成引起心律失常的环路。

心肌细胞缝隙连接通道的特异性蛋白包括Cx40和Cx43[7,8]，其正常表达和分布是缝隙连接通道电耦联和正常电活动以及协调心脏心肌舒缩的重要保证[9]。Cx43大部分在闰盘内。闰盘是由非特化肌膜、黏着膜、桥粒和间隙连接共同组成的，它是特化的心肌组织的传导结构。缝隙连接结构同时也是相邻细胞间传递化学信息、调节细胞分化和增殖的一种通讯连接方式，在心肌细胞中更具有传递电冲动的作用。而电信号在相邻心肌细胞间迅速传播是心室传导的重要决定因素，它使整个心脏肌肉细胞成为一个合胞体形式的完整的功能单位。Cx43表达量的减少及非均匀化可改变电传导的同向性，使电传导速率降低，且易形成折返，造成心律失常。而缝隙连接蛋白的侧面化，可使Cx43形成的半通道增多，可导致Na+内流和ATP外流，引起延迟后去极化。病理条件下，心肌Cx43的这些重构是构成心律失常的基础之一。

心房Cx40端-端分布减少，纵向的传导速度降低，也使心肌传导减慢，导致总的心房除极时间延长。同时，Cx40的异质性分布也使相邻细胞具有明显不同的阻抗和传导速度，因而产生许多微小的传导阻滞区，促使形成微小折返环路，导致房颤的发生和持续。Cx40表达量减少时，细胞间电耦联发生障碍，使心房的纵向传导速度减慢，而横向传导速度相对增加，复极离散度增加，多个子波沿异常的传导径路扩布，有利于微折返的形成，导致房颤的发生和持续[10]。Cx40量的改变、分布的变化、磷酸化状态的变化可引起缝隙连接重构，影响心房肌传导速度，并可能与心肌细胞炎性反应、纤维化等病理改变有关，在房颤等心律失常的发生中具有一定作用。

本研究发现，IPC和RIPC方式可能影响到Cx43和Cx40的表达和分布，即减少量的减少，以及减少其侧向分布，以消除或降低心房肌细胞间电信号的传导方向及速度，因此，对房性心律失常尤其是心房颤动的干预可能具有重要的意义。

本研究仅属于初步的探索研究，尚有很多的局限性。第一，以鼠为研究对象，与人差距甚大，不能证明IPC或RIPC对人类心房肌有同样的作用。第二，实验方法简单，仅提示存在这种可能的现象，尚需要结合多种实验方法或多种模型进一步证实。第三，选用的大鼠为健康大鼠，与病理状态下的情况完全不同，尚不能表明IPC系列方法对病理状态下如心房颤动心房肌Cx43和Cx40的影响，下一步应在心房颤动动物模型的基础上进行研究。

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Effect of ischemic preconditioning on atrial Cx43 and Cx40 after ischemia-reperfusion

HAN Jin-song，LI Zhi，WANG Hui-shan，et al.Department of Cardiac Surgery，General Hospital of Shenyang Command，Shenyang 110016，China

Objective To study the impact of ischemic preconditioning（IPC）on atrial gap junction protein connexin 43（Cx43） and 40（Cx40）and their distribution after ischemia-reperfusion.Methods 30 Wistar rats were randomly divided into sham group （or a control group，n=5）：only thread but not ligated left anterior descending coronary artery.Ischemia-reperfusion group（I/R group，n=5）：ligated anterior descending artery 30 min，and then reperfusion 120 min.Early ischemic preconditioning group （IPC group，n=5）：Line IPC after treatment，other deal with the same I/R group.Delayed IPC group（L-IPC group，n=5）：In the IPC after treatment 24 h，other deal with the same I/R group.Early remote ischemic preconditioning group（RIPC group，n=5）：After giving RIPC，other deal with the same I/R group.Delay RIPC Group（L-RIPC group，n=5）：RIPC treatment after 24 h，deal with the same I/R group.MRNA expression measurements Cx40，Cx43 of atrial tissue，protein expression and assay Cx40，Cx43 by immunohistochemical staining distribution.Results I/R group Cx43 and Cx40 mRNA levels and protein levels were significantly reduced，irregular distribution and the relative increase in side profile.The variety of ways IPC（IPC，L-IPC，RIPC，L-RIPC）after I/R，atrial Cx43 and Cx40mRNA no significant decline in levels and protein levels，and its distribution more than intercalated disk myocardial cells，only a small amount distributed in cardiomyocytes side.Conclusion IPC can maintain atrial Cx43 I/R after Cx40 expression and higher，and to maintain their spatial distribution is relatively stable.

Ischemic preconditioning； Connexin； Atrium； Arrhythmia

HAN Jin-song，E-mail：hanjs0216@sina.com

2014年辽宁省自然科学基金项目（项目编号：2014020065）；

2015年辽宁省自然科学基金项目（项目编号：2015020407）；

110016 辽宁省沈阳市，沈阳军区总医院心血管外科

韩劲松，E-mail：hanjs0216@sina.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．10．022

Q95-33；R541.7

A

1672-5301（2016）10-0948-04

2016-04-18）

2014年中华医学会胸心血管外科分会厄尔巴肯奖学金科研项目