PCBP2在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚发生中的作用

张韫佼 姜兆磊 司逸 马南 梅举

基础研究

PCBP2在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚发生中的作用

张韫佼 姜兆磊 司逸 马南 梅举

目的 探讨PCBP2在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚发生过程中的作用。方法 选取8～10周龄的雄性C57BL/6小鼠20只，体重23～28 g，随机分为2组，每组各10只，分别施以主动脉缩窄术（TAC组）和假手术（Sham组）。术后4周应用超声心动图评价小鼠的心脏功能，应用心脏重量与体重之比（HW/BW）定量评价心肌肥厚程度。Real-time PCR检测心肌肥厚标志物Nppa、β-MHC（Myh7）的mRNA水平，同时检测PCBP2 mRNA水平。Western blot方法检测Nppa、β-MHC及PCBP2的蛋白水平。比较分析两组之间的差异。结果 与Sham组相比，TAC组小鼠的心肌肥厚程度明显增加［TAC组（8.23±1.88）mg/g比Sham组（4.89±0.68）mg/g］，左心室射血分数［TAC 组（41.38±2.22）%比 Sham 组（59.15±3.58）%］及短轴收缩率［TAC 组（33.61±0.92）%比 Sham 组（43.87±1.37）%］明显降低（P＜0.05）。TAC 组的心肌肥厚标志物 Nppa、β-MHC 的mRNA水平及蛋白水平均明显高于Sham组（P＜0.05）。然而，TAC组PCBP2 mRNA水平及蛋白水平却明显低于Sham组（P＜0.05），与心肌标志物Nppa、β-MHC的变化趋势相反。结论 PCBP2在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚发生过程中起着负性调节作用，上调PCBP2表达可能会抑制心肌肥厚的发展。

PCBP2； 心肌肥厚； Nppa； β-MHC

肥厚型心肌病被认为是一种心血管遗传疾病，跟基因突变密切相关[1-3]。在一般人群中，肥厚型心肌病的发病约1/500。研究已证实，在胎儿心脏发育过程中，一组主要以编码心肌肌节蛋白基因发生突变是导致心肌肥厚的重要遗传基础。PCBP2是多聚胞嘧啶结合蛋白家族成员之一，能特异性结合富含胞嘧啶RNA片段，在基因表达的转录水平及转录后水平调控中发挥重要的作用[4,5]。有研究发现，PCBP2在心肌组织中有表达，表明PCBP2可能在心脏发育过程中也起着一定的调控作用[6]。那么，PCBP2在心肌肥厚过程中起着怎样的作用，目前尚不清楚。本研究拟通过应用主动脉缩窄术建立压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型，观察PCBP2与心肌肥厚标志物心房钠尿肽前体A（natriuretic peptide precursor-A，Nppa）及 β 肌球蛋白重链（β-Mysion Heavy Chain，β-MHC，由基因 Myh7编码）的表达情况，探讨PCBP2在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚发生中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性C57BL/6小鼠20只，体重23～28 g，8～10周龄，随机分为2组，每组各10只。主要仪器与试剂：小动物呼吸机（上海软龙科技发展有限公司BW-BM1103），显微外科手术器械（上海医疗器械有限公司手术器械厂），手术显微镜（上海光学仪器厂），超净工作台（苏州 SW-CJ.IFD），Real-time PCR仪（美国Bio-Rad），蛋白电泳仪（美国Bio-Rad），Western blot成像系统（美国Bio-Rad），戊巴比妥钠，异氟烷，蛋白定量试剂盒，定量PCR试剂盒。

1.2 方法

1.2.1 构建小鼠心肌肥厚模型 TAC组：将小鼠麻醉，气管插管后，平卧，固定在手术操作板上，消毒、铺巾。经左胸第2肋间进胸，用湿棉签拨开左肺组织，用镊子分离主动脉弓降支，将7-0手术缝线穿过分离出的间隙。在主动脉弓降支上方，平行插入一段26G的注射器针头，用穿过的7-0手术缝线将主动脉血管及针头一并结扎。最后拔出针头，关胸，即得到小鼠主动脉缩窄模型，用于构建压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型。Sham组：分离主动脉弓降支后，穿线但不结扎；最后抽出缝线，关胸。

1.2.2 测定小鼠的心脏功能及心肌肥厚情况 用异氟烷将小鼠麻醉后，取仰卧位，剃去左前胸部的毛，涂抹耦合剂。应用超声心动图准确测量小鼠的左室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）及左室短轴收缩率（fractional shortening，FS）。心肌肥厚定量：处死小鼠，测量小鼠的心脏重量及体重，应用心脏重量与体重之比（HW/BW）定量评价其心肌肥厚程度。

1.2.3 Real-time PCR检测 使用Premier 5.0软件进行引物设计，序列见表1。取小鼠心肌组织50 mg，按TrIzol Reagent（Invitrogen）说明书的步骤，抽提心肌组织RNA（100 ng），使用one-step RT-PCR kit（Qiagen）RT-PCR进行逆转录，然后通过Real-time PCR 分别检测心肌组织中 Nppa、β-MHC（Myh7）及PCBP2 mRNA水平。

1.2.4 Western blot检测 Western blot检测小鼠心肌组织中 Nppa、β-MHC（Myh7）及 PCBP2 蛋白水平：将100 mg小鼠心肌组织匀浆后，BCA法检测蛋白浓度，加样，电泳，免疫印迹，定量分析。

1.3 统计学方法 运用SPSS 18.0软件进行数据的统计学分析。计量数据以±s表示，两组之间比较采用t检验。P＜0.05表明差异有统计学意义。

表1 Real-time PCR引物序列

2 结果

2.1 心肌肥厚情况及心脏功能测定结果 心脏超声评估小鼠的心脏功能，结果显示，与Sham组相比，TAC组术后4周小鼠的HW/BW明显增加（P＜0.05），而 LVEF、FS 则明显下降（P＜0.05，见表 2），表明压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型构建成功。

表2 两组心肌肥厚情况及心脏功能测定结果（±s）

表2 两组心肌肥厚情况及心脏功能测定结果（±s）

注：HW/BW：心脏重量与体重之比；LVEF：左室射血分数；FS：左室短轴收缩率。与Sham组相比，aP＜0.05

组别 HW/BW（mg/g） LVEF（%） FS（%）Sham 组 4.89±0.68 59.15±3.58 43.87±1.37 TAC 组 8.23±1.88a41.38±2.22a33.61±0.92a

2.2 Real-time PCR检测结果 与Sham组相比，TAC组的Nppa、Myh7 mRNA水平明显升高。然而，TAC组PCBP2 mRNA水平则明显低于Sham组，与Nppa、Myh7 mRNA水平的变化趋势相反，表明PCBP2在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚发生过程中起着负性调节作用。见图1。

图1 Nppa、Myh7、PCBP2 mRNA相对表达情况

2.3 Western blot检测结果 与Sham组相比，TAC组的Nppa、Myh7蛋白表达明显增加。然而，TAC组PCBP2蛋白水平则低于Sham组，与Nppa、Myh7蛋白表达的变化亦呈相反趋势，也表明PCBP2在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚发生过程中起着负性调节作用。见图2。

图2 Myh7、Nppa、PCBP2 蛋白表达情况

3 讨论

肥厚型心肌病早期患者可以没有任何症状和不适，但是到了晚期可能会出现恶性心律失常、心衰甚至猝死，是导致年轻人猝死的首要原因[7]。然而，目前临床上仍缺乏治疗肥厚型心肌病的有效方法。因此，进一步深入研究肥厚型心肌病的发病机制、优化其治疗方案，对改善肥厚型心肌病的疗效及预后具有十分重要的意义。心脏负荷的增加被认为是引起心肌肥厚的主要原因。心肌细胞由于受到负荷的刺激，细胞核内DNA含量增加，RNA/DNA比值增大，蛋白质合成增加、线粒体体积变大。而由于哺乳动物心肌细胞已丧失有丝分裂能力，所以细胞数量不增，但每个细胞中的肌节数目增加，从而导致细胞变粗、变长，进而发生心肌肥厚。心肌肥厚是心脏力学改变引起的一系列生理生化的适应性反应，高血压、心肌缺血以及神经体液的激活，都可导致病理性的心肌肥厚。在心肌肥厚过程中，不仅心肌细胞的体积增大，细胞肌节数目也增加[8]。

目前，肥厚型心肌病被认为是遗传性疾病，与基因突变密切相关[1-3,9,10]。通过基因检测可以早期确诊肥厚型心肌病。心房钠尿肽前体A（Nppa）及β肌球蛋白重链（β-MHC）是常用的心肌肥厚标志物[11,12]。Nppa基因定位于染色体1p36，编码心房钠尿肽（ANP）的前体[12]。ANP是由心房肌细胞合成并分泌的肽类激素，主要作用是使血管平滑肌舒张和促进肾脏排钠、排水。β-MHC是肌球蛋白的重要组成部分，在心脏收缩功能中起着至关重要的作用[11]。Myh7基因是编码心脏β-MHC的基因，该基因对心肌肥厚和心脏功能有着重大影响，是公认的能引起心肌肥厚的主要致病基因[2,9]。以往的研究已证实，在心肌肥厚发生中，Nppa及β-MHC表达明显增加[11-13]。本研究通过应用主动脉缩窄术建立压力负荷成功构建出小鼠心肌肥厚模型，结果发现，与Sham组相比，TAC组小鼠的心肌肥厚程度明显增加，左心室射血分数及短轴收缩率明显降低；TAC组的心肌肥厚标志物Nppa、Myh7 mRNA水平及蛋白水平均明显增加，这与以往的研究结果相一致，从分子水平进一步验证了心肌肥厚模型构建成功。

PCBP2作为多聚胞嘧啶结合蛋白家族成员之一，可以特异性地与单链polyC富含区结合，可参与转录后调控、蛋白相互作用等过程，对RNA的复制和翻译起着重要的调控作用[4,5]。有围绕PCBP2的研究报道，主要集中于PCBP2调控病毒RNA的复制过程及与病毒之间的关系[14,15]。还有研究发现，PCBP2在肿瘤的调控中也起着重要作用[16,17]。此外，在心肌发育过程中，PCBP2也表达于心肌组织中，表明PCBP2可能在心脏发育过程中起着一定的调控作用[6]。但PCBP2在心肌肥厚过程中究竟起着促进作用还是抑制作用，目前仍不清楚。在本研究中，我们在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚模型中，应用Real-time PCR及Western blot检测小鼠心肌中PCBP2的表达情况，结果发现TAC组小鼠PCBP2 mRNA水平及蛋白水平明显低于Sham组，与心肌标志物Nppa、Myh7的变化趋势相反。因此我们推测，PCBP2在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚发生过程中起着负性调节作用，上调PCBP2表达可能会抑制心肌肥厚的发展。

综上所述，主动脉缩窄术建立的压力负荷可成功诱导构建出小鼠心肌肥厚模型，PCBP2在压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚发生过程中起着负性调节作用，其可能成为心肌肥厚治疗的新靶点，上调PCBP2的表达可能是治疗心肌肥厚的新策略。

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The effect of PCBP2 on the development of cardiac hypertrophy induced by pressure overloading in mice

ZHANG Yun-jiao，JIANG Zhao-lei，SI Yi，et al.Department of Cardiothoracic Surgery，Xinhua Hospital，School of Medicine，Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200092，China

Objective The pressure overload cardiac hypertrophy was constructed by transaortic constric－tion（TAC）in mice.To explore the effect of PCPB2 on the development of pressure overload cardiac hypertrophy in mice.Methods 20 male C57BL/6 mice（age 8-10 weeks，weight 23-28 kg）were used to construct the model.The mice were divided into 2 groups：TAC group（TAC surgery） and Sham group（Sham surgery）.Cardiac function was evaluated by echocardiography at postoperative 4 weeks.Also，the degree of cardiac hypertrophy was assessed with the ratio of heart weight/body weight（HW/BW）.Real-time PCR was used to detected the mRNA of PCBP2 and cardiac hypertrophic marker（Nppa，β-MHC）.Western blot was used to examined the protein of PCBP2 and cardiac hypertrophic markers（Nppa，β-MHC）.The differences between the two groups were analyzed.Results Compared with Sham group，cardiac hypertrophy and HW/BW ratio were significantly higher in TAC group［TAC group（8.23±1.88）mg/g vs Sham group（4.89±0.68）mg/g］，but cardiac function was lower in TAC group［LVEF：TAC group（41.38±2.22）%vs Sham group（59.15±3.58）%；LVFS：TAC group（33.61±0.92）%vs Sham group（43.87±1.37）%（P＜0.05）］.The mRNA or proteins of Nppa and β-MHC of TAC group were higher than those of Sham group（P＜0.05）.However，both the mRNA and protein of PCBP2 were significantly lower than those of Sham group（P＜0.05）.Conclusion PCBP2 was a negative factor for the development of pressure overload cardiac hypertrophy in mice.Upregulation of PCBP2 may be able to inhibit the development of cardiac hypertrophy.

PCBP2； Cardiac hypertrophy； Nppa； β-MHC

MEI Ju，E-mail：ju_mei63@126.com

国家临床重点专科项目（项目编号：）；上海申康医院发展中心新兴前沿技术项目（项目编号：SHDC12014107）；上海新华医院院级科研课题（项目编号：15YJ13）

200092 上海市，上海交通大学医学院附属新华医院心胸外科

梅举，E-mail：ju_mei63@126.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．10．021

Q95-33；R542.2

A

1672-5301（2016）10-0944-04

2016-05-07）