ANGPTL2与STEMI梗死相关动脉自溶再通的关系

郭玲玉 杨文龙 张明亮 陈一竹 许盛松 周璇 张俊峰

临床研究

ANGPTL2与STEMI梗死相关动脉自溶再通的关系

郭玲玉 杨文龙 张明亮 陈一竹 许盛松 周璇 张俊峰

目的 探讨血管生成素样蛋白2（ANGPTL2）与急性ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者梗死相关动脉自溶再通的关系。方法 选取上游使用替罗非班的STEMI患者88例，根据冠脉造影结果分为自溶再通组43例和未自溶再通组45例（对照组）。收集其外周静脉血，通过酶联免疫吸附法检测血浆ANGPTL2浓度，同时提取患者血小板蛋白，利用Western Blot检测ANGPTL2在血小板上的表达情况。结果 STEMI自溶再通组患者外周血血浆中ANGPTL2浓度显著高于未自溶再通组［（37.13±19.49）ng/ml比（26.97±16.91）ng/ml，P=0.011］，ANGPTL2在STEMI自溶再通组患者血小板上的表达显著高于未自溶再通组（P＜0.05）。结论 ANGPTL2与STEMI梗死相关动脉自溶再通呈正相关。

血管生成素样蛋白2； 急性ST段抬高型心肌梗死； 自溶再通； 血小板

急性ST段抬高型心肌梗死（ST elevated myocardial infarction，STEMI）是一类世界范围内发病率、死亡率都非常高的心血管疾病[1]。目前，对STEMI患者实施急救最重要的策略即再灌注治疗，包括静脉溶栓和经皮冠状动脉介入治疗术（percutaneous coronary intervention，PCI）。无论溶栓还是直接PCI，及早实现再灌注，缩短总缺血时间是治疗STEMI的核心和关键[2]。随着直接PCI术在STEMI治疗中的广泛应用，通过急诊冠脉造影发现部分STEMI患者在冠脉造影前梗死相关动脉已呈开通状态，且达到心肌梗死溶栓治疗临床试验（TIMI）血流2～3级，这种现象称为梗死相关动脉的自溶再通（spontaneous recanalization，SR）[3]。但是，自发再通的机理并不明确，可能与内源性血栓自溶或者冠状动脉痉挛的缓解有关[4]。我们前期进行的单中心回顾性分析发现，及早使用抗血小板药物替罗非班可使STEMI患者梗死相关动脉自溶再通的发生率显著升高而增加临床获益[5]。

最近研究发现，血小板上高表达一种分泌性糖蛋白——血管生成素样蛋白2（angiopoietin like protein 2，ANGPTL2），并且可以储存在血小板α颗粒中。ANGPTL2有2个受体小鼠配对免疫球蛋白样受体B（paired immunoglobulin-like receptors B，PIRB）或人类白细胞免疫球蛋白样受体B2（leukocyte immunoglobulin-like receptor B2，LILRB2）在小鼠和人类的血小板上高表达。ANGPTL2可以借助上述两个受体经过一系列信号转导途径最终作用于血小板上的GPⅡb/Ⅲa受体，导致GPⅡb/Ⅲa受体功能缺陷，抑制血小板聚集[6]。ANGPTL2作为血小板的又一负反馈机制，可由血小板释放而抑制白色血栓形成。本研究拟探讨ANGPTL2与STEMI梗死相关动脉自溶再通的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本试验入选了2014年8月至2015年10月入住上海第九人民医院的上游（指在入院后，冠脉介入治疗之前使用替罗非班）使用替罗非班的STEMI患者88例，根据冠脉造影结果分为自溶再通组43例和未自溶再通（no spontaneous recanalization，NSR）组45例（对照组）。入选标准：STEMI患者诊断均符合《2012年中国经皮冠状动脉介入治疗指南》标准，所有患者均有典型的胸痛持续30 min以上，12 h内相邻导联心电图ST段抬高，血清心肌酶学标志物升高[7]。自溶再通组患者梗死相关动脉PCI治疗前血流均达到TIMI血流2～3级[3]。排除标准：近期出血性疾病、脑血管意外、外伤、大手术等，急性感染、肿瘤、全身炎症性疾病、自身免疫性疾病等，严重的肝肾功能不全，冠脉造影前未使用替罗非班。本研究患者均签署知情同意并通过伦理委员会审查。

1.2 资料收集 患者入院后进行常规体格检测和生化指标检测，收集临床资料，建立受试者档案。

1.3 样本收集 所有患者在入院后冠脉造影时采集外周静脉血，肝素钠抗凝。①分离外周血血浆：室温，3000 r/min离心15 min，分离血浆，分装，-80℃保存，备用。②分离血小板：加0.9%生理盐水（1∶1），混匀，加 Apyrase（1∶2000，Sigma-Aldrich 公司），加PGE1（1∶10 000，Sigma-Aldrich 公司），混匀，室温，1050 r/min离心10 min，取上层富血小板血浆至另一新离心管，加 Apyrase（1∶2000），加 EDTA（0.5 mM，1∶100），混匀，室温，1900 r/min 离心 10 min。弃上清，加Tyrode′s buffer重悬血小板，计数达到3×108/ml加 2×SDS裂解液（1∶1），分装，-80 ℃保存备用[8,9]。

1.4 方法 所有入选患者采用桡动脉途径行PCI。术前替罗非班使用起始剂量依照体重10 μg/kg推注，维持滴注速率 0.15 μg·kg-1·min-1，维持 36 h。

采用ELISA法检测样本外周血血浆ANGPTL2浓度。Enzyme-linked Immunosorbent Assay Kit For ANGPTL2购自Uscn Life Science Inc.公司。严格按照试剂盒说明书中的试验步骤及注意事项进行操作。利用酶标仪在450 nm波长下测定吸光值，制作标准曲线，根据吸光值计算样本的ANGPTL2浓度。利用Western blot技术检测ANGPTL2在STEMI患者血小板上的表达情况。Goat Anti-ANGPTL2抗体购自R&D Systems公司。

1.5 统计学方法 使用SPSS 16.0对数据进行分析。首先进行正态性检验和方差齐性检验。计量资料符合正态分布用±s表示，方差齐性时组间比较采用独立样本t检验，方差不齐时采用两独立样本Welch校正t检验，不符合正态分布用中位数（四分位距）表示，组间比较采用非参数检验。计数资料用百分率表示，组间比较采用卡方检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者临床资料比较 自溶再通组和未自溶再通组的年龄、性别、体重，替罗非班的起始推注量、维持剂量，高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟史、梗死前心绞痛、Kiliip分级、血压、血糖、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）、术前LVEF比较未见统计学差异（P均＞0.05）；术前LVEF≥55%两组差异有统计学意义（P＜0.01）。见表 1。

2.2 ANGPTL2在外周血血浆中的表达ANGPTL2在自溶再通组中的表达显著高于未自溶再通组［（37.13±19.49）ng/ml比（26.97±16.91）ng/ml，P=0.011］，差异有统计学意义，见图1。

2.3 ANGPTL2在SR血小板上的表达 ANGPTL2在自溶再通组血小板上的表达显著高于未自溶再通组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

3 讨论

血小板来源的ANGPTL2可通过其受体PIRB/LILRB2作用于下游信号分子酪氨酸磷酸酶Shp，使其磷酸化增强，Shp磷酸化后起负性调控作用，进而导致下游信号分子黏着斑激酶FAK和GPⅡb/Ⅲa受体β3亚基的脱磷酸化或是β3亚基的裂解，导致GPⅡb/Ⅲa受体功能缺陷，抑制血小板的聚集，抗血栓形成[6]。

表1 两组患者基线特征比较［±s，例数及百分率（%）］

表1 两组患者基线特征比较［±s，例数及百分率（%）］

注：LVEF：左室射血分数；TC：总胆固醇；TG：甘油三酯；LDL：低密度脂蛋白；HDL：高密度脂蛋白；hs-CRP：高敏C反应蛋白

组别 例数 年龄（岁） 男性 体重（kg） 替罗非班起始推注量（μg）替罗非班使用到采血的维持剂量（μg） 目前吸烟 既往吸烟 高血压自溶再通组 43 62.63±10.81 39（90.7） 67.07±6.90 670.7±69.0 357.84±178.45 26（60.5） 1（2.3） 27（62.8）未自溶再通组 45 62.44±14.11 38（84.4） 66.36±7.36 663.6±73.6 352.23±162.19 20（44.4） 3（6.7） 26（57.8）t/χ2/Z值 0.069 0.786 0.469 0.469 0.154 2.262 0.955 0.231 P值 0.945 0.499 0.640 0.640 0.878 0.133 0.326 0.631组别 糖尿病 高脂血症 梗死前心绞痛 术前LVEF（%） 术前LVEF≥55%Killip分级ⅠⅡⅢ自溶再通组 14（35.0） 11（25.6） 19（44.2） 55.0±7.4 28（65.1） 39（90.7） 3（7.0） 1（2.3）未自溶再通组 9（20.0） 12（26.7） 16（35.6） 52.1±6.4 16（35.6） 41（91.1） 4（8.9） 0（0.0）t/χ2/Z值 1.796 0.013 0.684 1.922 7.686 0.000 0.000 -P值 0.180 0.908 0.408 0.058 0.006 1.000 1.000 -组别 收缩压（mm Hg）hs-CRP（mg/L）自溶再通组 132.36±16.54 80.07±10.32 5.80（5.20～8.30） 4.54±1.15 1.23（0.73～2.01） 2.55（1.85～3.18） 1.09±0.27 6.00（3.4～14.0）未自溶再通组 127.27±20.56 77.22±14.05 6.00（5.40～7.45） 4.82±1.22 1.13（0.88～1.96） 2.63（2.18～3.26） 1.08±0.23 6.00（4.0～16.0）t/χ2/Z值 1.344 1.080 -0.071 1.125 -0.630 -1.361 0.140 -0.391 P值 0.182 0.283 0.943 0.264 0.529 0.174 0.889 0.696舒张压（mm Hg）空腹血糖（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）HDL（mmol/L）

图1 ANGPTL2在SR和NSR患者外周血血浆中的表达

图2 ANGPTL2在SR和NSR患者血小板上的表达

梗死相关动脉的自溶再通在STEMI患者中的发生率高达7%～27%[10,11]。尽早开通STEMI患者梗死相关动脉，恢复至TIMI血流2～3级，对于改善左心功能、降低心力衰竭的发病率和死亡率、改善临床预后具有重要意义。以下几种情况参与STEMI患者梗死相关动脉自溶再通的发生：纤溶系统激活，逐渐溶解动脉血栓，阻塞的冠脉血管重新开放[12]；持续冠脉血管痉挛的恢复[4]；血小板聚集的抑制。研究表明，抗血小板聚集可以提高梗死相关动脉的早期开放率并促进其血流恢复至TIMI 3级，促进自溶再通的发生[13]。血小板释放ANGPTL2经过一系列信号转导最终作用于GPⅡb/Ⅲa受体，导致其功能缺陷，从而阻断其与纤维蛋白原的结合，抑制血小板之间的聚集。

我们的研究显示，ANGPTL2在STEMI患者自溶再通组外周血血浆中的表达显著高于未自溶再通组，差异有统计学意义。为进一步证明ANGPTL2的高表达是否来源于血小板，我们比较了两组患者血小板上ANGPTL2的表达水平，结果发现，在自溶再通组患者血小板上ANGPTL2的表达也高于未自溶再通组，差异有统计学意义。我们有理由相信，ANGPTL2与STEMI患者自溶再通呈正相关。

自溶再通的发生除了上述机制外还有众多其他的影响因素，例如抗栓药物如替罗非班的使用、入院前较好的心脏功能等。还有研究显示，梗死前心绞痛、Killip分级Ⅰ级与自溶再通呈正相关[4,5]。本研究入选的患者全都术前使用替罗非班，两组患者术前LVEF、梗死前心绞痛、Killip分级比较，均未见统计学差异；但是纤溶系统的激活和血管痉挛的恢复这两个机制我们试验并没有考虑在内。然而通过我们的试验，ANGPTL2在自溶再通患者血浆及血小板上的高表达是明确的，ANGPTL2与自溶再通呈正相关。

综上所述，ANGPTL2从血小板中释放，抑制血小板的过度活化和聚集。血小板的这种自我负性调控有可能是STEMI患者梗死相关动脉自溶再通的又一机制。ANGPTL2与自溶再通的关系我们还将深入到基因水平，系统地研究ANGPTL2参与自溶再通的机制。

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Relation between ANGPTL2 and STEMI spontaneous recanalization of the infarct-related artery

GUO Ling-yu，YANG Wen-long，ZHANG Ming-liang，et al.Department of Cardiology，Shanghai Ninth People′s Hospital，Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 201999，China

Objective To explore the relation between ANGPTL2 and STEMI spontaneous recanalization of the infarct-related artery.Methods 88 patients with STEMI were accepted upstream Tirofiban treatment，and according to coronary angiography they were divided into two groups，those with spontaneous reperfusion（the SR group）（n=43）and those with no spontaneous reperfusion（the NSR group）（n=45）.ANGPTL2 concentration in peripheral blood plasma was detected using enzyme-linked immunosorbent assay.Western blot analysis was performed to detect ANGPTL2 protein expression in platelets from patients with SR and NSR.Results ANGPTL2 level in patients with SR was significantly higher than that in patients with NSR［（37.13±19.49）ng/ml vs（26.97±16.91）ng/ml，P=0.011］.ANGPTL2 was highly expressed in platelets of patients with SR.Conclusion ANGPTL2 is positively correlated with STEMI spontaneous recanalization of the infarct-related artery.

Angiopoietin-like protein 2； ST elevated myocardial infarction； Spontaneous recanalization；Platelet

ZHANG jun-feng，E-mail：jfzhang_dr@163.com

上海市自然科学基金（项目编号：16ZR1419900）

201999 上海市，上海交通大学医学院附属第九人民医院心内科

张俊峰，E-mail：jfzhang_dr@163.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．10．007

R542.2+2

A

1672-5301（2016）10-0891-04

2016-02-17）