c-FLIP 在不同宫颈组织中的表达及临床意义

陈　聃，凌　文，陈　赛（长沙市第三医院妇产科，湖南长沙410015）

·论著·

c-FLIP 在不同宫颈组织中的表达及临床意义

陈聃，凌文，陈赛（长沙市第三医院妇产科，湖南长沙410015）

目的研究c-FLIP在宫颈癌、宫颈上皮内瘤变（CIN）、正常宫颈的表达情况。方法选取2010～2014年该院病理科存档且临床资料完整的妇产科门诊及住院患者的宫颈组织蜡块共118例，其中正常宫颈18例，宫颈上皮内瘤变Ⅰ级（CINⅠ级）17例，宫颈上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级（CINⅡ～Ⅲ级）16例，宫颈癌67例，采用免疫组化SP方法检测c-FLIP在正常宫颈、CIN、宫颈癌中的表达，并对宫颈癌的FIGO分期、有无淋巴结转移、分化程度和病理类型等进行相关性分析。结果c-Flip在正常宫颈、CINⅠ级、CINⅡ～Ⅲ级以及宫颈癌组中的阳性表达率分别为11.1%、23.5%、62.5%、85.1%，CINⅡ～Ⅲ级组、宫颈癌组与正常宫颈组、CINⅠ级组比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而宫颈癌组与CINⅡ～Ⅲ级组、CINⅠ级组与正常宫颈组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。c-FLIP蛋白在宫颈癌低分化组阳性表达率均高于高、中分化组（P＜0.05），而与患者的FIGO分期、淋巴结转移及病理类型无关（P＞0.05）。结论c-FLIP与宫颈癌的发生、发展密切相关，对宫颈癌病变程度的评估有一定参考价值，可能成为治疗宫颈癌的潜在靶点。

c-FLIP；宫颈肿瘤；宫颈上皮内瘤样病变；子宫颈；免疫组织化学

宫颈癌是目前全世界最为常见的妇科恶性肿瘤之一，在全世界女性中的发病率仅次于乳腺癌，也是发展中国家女性最主要的死亡原因之一。近年来，宫颈癌的发病率明显增加，而且其发病率还有年轻化的趋势。宫颈癌的发生、发展是一个复杂而且漫长的过程，并且由多种基因参与，随着分子生物学技术的逐渐发展，研究者发现无论是肿瘤增殖还是凋亡，都与肿瘤相关基因的表达与调控有关。近几年新发现，c-FLIP蛋白也属于一类天然存在的凋亡抑制蛋白，具有死亡效应结构［1］。有研究表明，在多种人类肿瘤组织中c-FLIP蛋白呈高表达状态，且与许多人类肿瘤的发生、发展关系密切［2］，

本研究旨在初步探讨c-FLIP蛋白在宫颈不同组织中表达的临床意义，具体报道如下。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2010～2014年本科手术或者活检患者，经本院病理科阅片证实的宫颈组织蜡块共118例，其中正常宫颈18例，宫颈上皮内瘤变Ⅰ级（CINⅠ级）17例，宫颈上皮内瘤变Ⅱ～Ⅲ级（CINⅡ～Ⅲ级）16例，宫颈癌67例，67例宫颈癌患者年龄25～73岁，平均（47.22± 9.71）岁，其中鳞癌50例，腺癌17例；根据分化程度分，高中分化16例，低分化51例；＞40岁49例，≤40岁18例；FIGO临床分期，Ⅰ期27例，Ⅱa～Ⅱb期40例；有无淋巴结转移，淋巴结转移阴性49例，阳性18例；16例CINⅡ～Ⅲ级患者年龄27～57岁，平均（41.44±8.33）岁。17例CINⅠ级患者，年龄23～47岁，平均（34.88±7.38）岁。18例正常宫颈患者，年龄29～51岁，平均（38.94± 6.47）岁。所选病例临床资料完整。

1.2方法

1.2.1免疫组化兔抗人c-FLIP多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司，兔Streptavidin-HRP试剂盒购买于北京康为世纪生物科技有限公司。石蜡切片常规脱蜡水化，内源性过氧化物酶封闭，微波抗原修复，血清封闭，兔抗人c-FLIP多克隆抗体1∶150 4℃孵育过夜，再以生物素标记的羊抗兔IgG 37℃孵育15 min，HRP标记链霉素亲和素37℃孵育10 min，最后用DAB显色，苏木素复染，乙醇逆度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。每一步骤间均用pH7.4 PBS缓冲液漂洗3次，每次5 min。

1.2.2判断标准用PBS代替一抗作为空白对照，用生物公司提供的阳性切片作为阳性对照。参照Axiotis等［3］的标准，阳性细胞所占比例和高倍镜（×400）下综合染色强度进行半定量测定。c-FLIP的阳性表达主要在细胞质中出现淡黄色至棕褐色颗粒，阴性者无此变化。镜下取5个（400×）高倍镜视野，每个视野计数200个左右细胞，判断标准如下：（1）计数阳性细胞数占细胞总数的比例并评分：4分：＞75%；3分：＞50%～75%；2分：＞25%～50%；1分：＞5%～25%；0分：0%～5%。（2）根据着色细胞的着色强弱评分：3分：棕褐色；2分：棕黄色；1分：淡黄色；0分：无着色。（3）以上2项评分结果相加后判断：5～7分：+++；3～4分：++；1～2分：+；0分：-。统计分析时（-）为阴性表达，（+）、（++）、（+++）均为阳性表达。

1.3统计学处理应用SPSS20.0统计软件进行数据分析，计数资料以率或构成比表示，采用χ2检验，计量资料以表示，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结　果

2.1c-FLIP蛋白在CIN、宫颈癌中及正常宫颈中的表达在细胞质里面，主要是c-FLIP蛋白的阳性表达区，阳性细胞往往呈淡黄色至棕褐色颗粒，正常宫颈中未见明显c-FLIP染色阳性细胞（图1），CIN中c-FLIP染色阳性细胞呈弥散分布（图2），而宫颈癌中c-FLIP染色阳性细胞成团分布（图3）。

图1　正常宫颈中c-FLIP呈阴性表达（左图：×100；右图：×400）

图2　CINⅢ中c-FLIP呈阳性表达（左图：×100；右图：×400）。

图3　宫颈癌中c-FLIP呈阳性表达（左图：×100；右图：×400）。

c-FLIP蛋白在正常宫颈、CINⅠ级、CINⅡ～Ⅲ级以及宫颈癌组中的阳性表达率分别为 11.1%（2/18）、23.5%（4/17）、62.5%（10/16）、85.1%（57/67），呈逐渐递增的趋势，见表1。除宫颈癌组与CINⅡ～Ⅲ级组、CINⅠ级组与正常宫颈组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）外，其余各组间两两比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1　c-FLIP蛋白在正常宫颈、CIN及宫颈癌组织中的表达情况

2.2c-FLIP蛋白的表达与宫颈癌临床病理参数之间的关系FIGOⅠ期宫颈癌患者c-FLIP蛋白阳性表达率为77.8%（21/27），Ⅱa～Ⅱb期宫颈癌患者c-FLIP蛋白阳性表达率为90.0%（36/40），两组间比较，差异无统计学意义（P=0.304）；c-FLIP蛋白在淋巴结转移阳性组的阳性表达率为94.4%（17/18），在淋巴结转移阴性组的阳性表达率为81.6%（40/49），两组间比较，差异无统计学意义（P=0.359）；c-FLIP蛋白在低分化组的阳性表达率为92.2%（47/51），在高分化组的阳性表达率为62.5%（10/16），两组比较，差异有统计学意义（P=0.012）；c-FLIP蛋白在宫颈鳞状细胞癌组中的阳性表达率为84.0%（42/50），在宫颈腺癌组中的阳性表达率为88.2%（15/17），两组间比较，差异无统计学意义（P=0.977）。见表2。

表2　c-FLIP蛋白的表达与宫颈癌临床病理参数之间的关系

3　讨　论

随着分子生物学的发展，人们逐渐认识到恶性肿瘤的发生、发展过程中存在多个功能不同的基因异常激活或者失活，即细胞的癌变是由多基因、多阶段互相配合、共同作用的结果。不仅仅是细胞增殖失控、分化异常的结果，更重要的是与细胞凋亡调节失控（凋亡程序被抑制，细胞周期调控被破坏）有密切的关系。细胞凋亡（apoptosis）又称程序性细胞死亡，是一种自主性细胞有序死亡的过程，并在复杂和严格的信号网络调控下完成，而这些因素又是体外诱因，细胞凋亡受到死亡配体、化疗药、DNA损伤、紫外线、细胞因子等多种因素的影响，正常情况下，体内细胞凋亡平衡，维持着自身细胞增殖和死亡之间的动态平衡。与凋亡相关的信号通路有线粒体依赖的内源性凋亡通路和配体结合诱导的外源性凋亡通路。细胞通过影响内源性或者外源性的机制来逃避凋亡，从而导致肿瘤的发生。因此，为了更进一步了解肿瘤的发生，提高临床肿瘤的诊治率，加强细胞凋亡相关的因子研究无疑是一种有效的途径。

FLIP是由Thome等［4］于1997年发现，病由所在研究的病毒中首次分离出来，并发现有疱疹病毒编码，称之为vFLIP（viral FLIP）。同年，Irmler等［5］推测FLIP也可能存在细胞中，随后在研究恶性黑色素瘤时发现肿瘤细胞质内亦存在可以抑制细胞凋亡的高表达的FLIP，首先将其命名为c-FLIP（cellular FLIP，c-FLIP）。c-FLIP被认为是一种重要的细胞凋亡抑制蛋白，其过量表达能抑制Fas，TRAIL-R，DR3，TNFR-1等介导的凋亡途径，使异常的肿瘤细胞凋亡减少，从而使肿瘤细胞数目增加，最终发展为癌变。c-FLIP在病毒、真核生物、哺乳动物等许多物种中广泛存在，定位于人染色体2号染色体长臂3区3-4带（2q33-34），目前已经鉴定出13个基因型，但仅有3个可转录出蛋白：长片段c-FLIPL、短片段c-FLIPS及来自淋巴瘤细胞c-FLIPR，其相对分子质量分别为55×103、26×103、24×103。三者在N端均存在2个串联的与Fas的死亡结构域（death domain，DD）的功能相似的含40个氨基酸死亡效应结构域（DED），但是在C端则差异很大。c-FLIPL与c-FLIPS、c-FLIPR比较，C端多了Caspase蛋白水解酶区域，即一个与Caspase8相似的Caspase同源结构域，但由于组氨酸和半胱氨酸在Caspase8中主要起催化的作用，而这2个氨基酸残基在c-FLIP中却被精氨酸和酪氨酸替代，因而c-FLIP便丧失了蛋白水解酶的活性，可竞争性结合Fas相关死亡区（Fas-associated death domain，FADD）或Caspase8/10上的死亡效应区（DED），阻断死亡信号复合体（DISC）形成和Caspase8/10的活化，使Caspase8的级联反应不能继续，从而抑制死亡受体Fas介导的细胞凋亡［1］。目前Fas-FasL介导的信号通路是研究较为清楚的细胞凋亡途径。Fas 与FasL识别后被活化，形成聚合体，使Fas的DD聚集，Fas以DD为桥梁与FADD结合，形成死亡诱导信号复合体（death-inducing signaling complex，DISC），之后借其DED与Caspase8前体的DED结合，使Caspase8前体寡聚，并使其活化为Caspase-8，进而活化下游Caspase效应子（caspase-3，caspase-7），产生级联反应，最终使细胞凋亡。

c-FLIP蛋白在许多肿瘤中高表达，而在其对应的良性病变或正常组织中低表达或者不表达。相关研究发现在恶性黑色素瘤中c-FLIP蛋白表达率明显高于良性病变。亦有研究表明c-FLIP蛋白在其他肿瘤组织中高表达［6-7］，而其对应的正常组织或者良性病变中不表达或者低表达。Wilkie-Grantham等［8］用42例子宫内膜癌和22例正常子宫内膜进行免疫组化，发现c-FLIP蛋白在前者中明显强表达。陈立立等［9］在动物实验中发现，卵巢癌动物血清中的c-FLIP蛋白表达明显增多。本研究结果显示c-FLIP蛋白表达阳性的细胞呈淡黄色至棕褐色颗粒，阳性着色主要位于细胞质中。c-FLIP蛋白的表达水平随着宫颈病变级别的升高而有明显增高趋势，且宫颈癌组、CINⅡ～Ⅲ级组与正常组、CINⅠ级组比较，差异有统计学意义。提示检测c-FLIP蛋白可能参与了宫颈癌的发病过程。

此外，本研究还探讨了c-FLIP蛋白与宫颈癌临床病理参数之间的关系，结果证实c-FLIP蛋白的表达与FIGO分期、有无淋巴结转移及病理类型无关，仅与细胞分化程度相关，在低分化组高表达，在高分化组低表达。提示检测c-FLIP蛋白可能有助于宫颈癌病变程度的评估。有研究报道，在乳腺癌中c-FLIP蛋白的表达与乳腺癌组织分级之间有显著相关性，随组织分级增高表达升高［10］，此与本研究结果相似。然而也有不少研究结果与本研究有差别，如c-FLIP蛋白的表达水平与子宫内膜癌的临床分期及肌层浸润深度呈显著性相关，在临床分期较晚和肌层浸润较深组c-FLIP蛋白表达水平显著增高［11］。其表达与胃癌的浸润转移密切相关［7］。而cFLIP蛋白在不同肿瘤中的作用有所不同，可能是因为cFLIP蛋白存在其他调节机制，从而使其对不同肿瘤的生物学行为有不同的影响，这值得进一步研究。

综上所述，c-FLIP可能参与了宫颈癌的发病过程。c-FLIP蛋白在低分化组中的表达高于高中分化组，提示c-FLIP对宫颈癌病变程度的评估有一定参考价值。

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Expression and clinical significance of c-FLIP in different cervical tissues

Chen Dan，Ling Wen，Chen Sai（Department of

Obstetrics and Gynecology，Changsha Municipal Third Hospital，Changsha，Hunan 410015，China）

ObjectiveTo detect the expression situationof c-FLIP in cervical carcinoma，CIN and normal cervix.MethodsA total of 118 paraffin embedded cervical tissue samples in the pathology department of our hospital for keeping in the achieves and with intact data during 2010-2014 were selected，including 18 cases of normal cervix，17 cases of cervical intraepithelialneoplasia gradeⅠ（CINI），16cases of CINgradeⅡ-Ⅲ（CINⅡ-Ⅲ）and 67 cases of cervicalcancer.The immunohistochemical SP method was used to detect the expression of c-FLIP protein in normal cervix，CIN and cervical carcinoma.Then the correlation analysis of the cervical cancer clinical FIGO classification，lymph node metastasis，differentiation degree and pathological type was performed.ResultsThe positive expression rates of c-FLIP in normal cervix，CINⅠ，CINⅡ-Ⅲand cervical cancer tissues were 11.1%，23.5%，62.5%and 85.1%respectively，the differences between the CINⅡ-Ⅲgroup and cervical cancer group with the normal cervix group and CINⅠgroup were statistically significant（P＜0.05），but the differences between the cervical cancer group and CINⅡ-Ⅲgroup and between the CIN I group and normal cervix group were not statistically significant（P＞0.05）.The positive expression rate of c-FLIP in the low differentiation group of cervical cancer was higher than that in the high and middle differentiation groups（P＜0.05），while which had no relation with the FIGO classification，lymph node metastasis and pathological type（P＞0.05）.Conclusionc-FLIP is closely related with the occurrence and progression of cervical cancer，has certain reference value for evaluating the cervical cancer lesion and may become a potential target point for treatming cervical cancer.

c-FLIP；Uterine cervical neoplasms；Cervical intraepithelial neoplasia；Cervix uteri；Immunohistochemistry

·论著·

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.03.009

A

1009-5519（2016）03-0346-03

陈聃（1981-），主治医师，硕士研究生，主要从事妇产科临床工作。

（2015-10-12）