反相高效液相色谱法测定复方肝浸膏片中维生素B1、维生素B2的含量

曾玉梅

(梅州市食品药品监督检验所化学室，广东 梅州　514071)



反相高效液相色谱法测定复方肝浸膏片中维生素B1、维生素B2的含量

曾玉梅*

(梅州市食品药品监督检验所化学室，广东 梅州514071)

目的：建立复方肝浸膏片中维生素B1、维生素B2的含量测定方法。方法：采用反相高效液相色谱法测定，色谱柱为SHIMADZU shim-packVP-ODS(250 mm×5 mm，4.6 μm)；流动相为甲醇-有机溶液(V∶V=9 ∶91)；检测波长为266 nm；流速为1.0 ml/min。结果：维生素B1质量浓度在7.65～153.15 μg/ml范围内、维生素B2质量浓度在2.54～50.85 μg/ml范围内的线性关系良好，回归方程维生素B1为Y=94.16X+10.34,r=1.000；维生素B2为Y=34.22X+29.61,r=1.000；加样回收率符合要求。结论：该方法操作简便、快捷、结果准确，可作为复方肝浸膏片的质量控制方法。

复方肝浸膏片； 维生素B1； 维生素B2； 含量测定

复方肝浸膏片是由肝浸膏、枸橼酸铁铵、维生素B1、维生素B2及干酵母制成的复方制剂，帮助身体恢复造血功能。据查目前国内有48个企业生产该品种，适用于缺铁性贫血，营养性贫血，失血性贫血，孕期、哺乳期妇女贫血、儿童生长发育期贫血[1]。其每片含维生素B1200 μg、维生素B270 μg。维生素B1参与机体糖的代谢过程，维持神经、心脏及消化系统正常机能；维生素B2参与碳水化合物、蛋白质、核酸和脂肪的代谢可提高肌体对蛋白质的利用率，参与细胞的生长代谢，改善贫血症状[2]。复方肝浸膏片的国家标准[3]中，未对其中的维生素B1、维生素B2进行质量控制。为提高本品的质量标准，本研究参照相关文献[4-11],采用反相高效液相色谱法同时测定复方肝浸膏片中的维生素B1、维生素B2的含量，所建立的方法具有良好的重现性和准确性，为本品中维生素B1、维生素B2的质量控制提供科学依据。

1　材料

1.1仪器

Agilent 1200型高效液相色谱仪及其工作站(安捷伦科技有限公司)；LC-20AT型高效液相色谱仪(含二极管阵列检测器)、AUW220D型电子分析天平(日本岛津公司)；MODEL HN1006型超声波清洁器(宁波新芝生物科技股份有限公司)；YB-3型澄明度检查仪(天大天发科技有限公司)；DHG-9070A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2试药

维生素B1对照品(批号：100390-200703，含量为100.0%)、维生素B2对照品(批号：100369-200502，105 ℃干燥2 h后使用，含量为98.7%)均由中国药品生物制品检定研究院提供；复方肝浸膏片(临汾奇林药业有限公司，批准文号：国药准字H14022800，批号：1312161、1305151、1304171，每片含维生素B1200 μg、维生素B270 μg)；甲醇、乙腈(天津四友精细化工有限公司，色谱纯)，水为超纯水，其他均为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：SHIMADZU shim-pack VP-ODS(250 mm×5 mm，4.6 μm)；流动相：甲醇-有机溶液[甲醇-乙腈-0.02 mol/L庚烷磺酸钠溶液(含1%三乙胺，用磷酸调节pH至5.5)(V∶V∶V=9 ∶9 ∶82)](V∶V=9 ∶91)；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。系统适用性中维生素B1和维生素B2分离度要符合要求。

2.2溶液的制备

2.2.1制备对照品溶液：精密称取维生素B1对照品0.030 63 g、维生素B2对照品0.010 17 g，分别置100 ml量瓶中，加有机溶液适量，超声处理5 min使溶解，放冷至室温，用有机溶液稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液；分别精密称取维生素B1对照品溶液及维生素B2对照品储备溶液5 ml置25 ml量瓶中，用有机溶液稀释刻度，摇匀，即得对照品溶液。

2.2.2制备供试品溶液：精密称取样品3片量，置10 ml量瓶中，加有机溶液适量，超声处理5 min使其溶解，放冷，再加有机溶液稀释至刻度,摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3制备阴性对照溶液：按复方肝浸膏片处方及制备工艺，制备不含维生素B1、维生素B2的阴性对照样品(即除去维生素B1、维生素B2及干酵母)，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3系统适应性试验

按“2.1及2.2”项下色谱条件，分别取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μl进样，结果供试品溶液中各组分之间分离度较好(R>1.5),见图1，阴性对照溶液色谱中无干扰峰出现，证明该方法专属性强。

2.4线性关系考察

精密量取对照品储备溶液5 ml，分别置于10、25、50、100、200 ml容量瓶中，用有机相稀释制成含维生素B1质量浓度为153.15、61.26、30.63、15.31、7.65 μg/ml，维生素B2质量浓度为50.85、20.34、10.17、5.08、2.54 μg/ml混合对照品溶液，分别吸取10 μl注入高效液相色谱仪，测定并分别记录峰面积。以各峰面积为纵坐标(Y)，相对应得对照品浓度为横坐标(X)绘制标准曲线，可测得线性回归方程为维生素B1为Y=94.16X+10.34,r=1.000；维生素B2为Y=34.22X+29.61,r=1.000。结果显示所测目标成分具有良好的线性关系。

2.5精密度试验

精密吸取“2.2.1对照品溶液”项下的对照品溶液10 μl，注入色谱仪中，重复进样6次，以峰面积计算，结果测得维生素B1的RSD=0.35%，维生素B2的RSD=0.25%。

2.6稳定性试验

取批号为1312161的供试品溶液，分别在0、1、2、4、6、12 h内分别进样10 μl，结果显示维生素B1峰面积的RSD=0.72%，维生素B2峰面积的RSD=0.95%，表明本品的供试品溶液在12 h内基本稳定不变质。

2.7破坏性试验

精密称取5份样品细粉适量，分别为样品1、2、3、4、5，样品1加入稀盐酸1 ml混匀，放置2 h；样品2加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液1 ml混匀，放置30 min；样品3加入0.3%过氧化氢溶液1 ml混匀，放置10 min，样品4、5不加任何试剂。样品1、2分别用等量的碱、酸中和；样品4置于110 ℃干燥箱中放置1 h；样品5置于1 000 lx照度下光照12 h。将所破坏性试验样品按“2.2.2”项下制备后分别进样10 μl，记录色谱图。结果表明各降解产物与主成份峰均能完全分离，维生素B1和维生素B2的测定不受辅料和降解产物的干扰，经二级管阵列检测器(DAD)检测维生素B1及维生素B2的峰纯度均能达到99%以上。维生素B1在酸、碱、氧化及热破坏后峰面积均有一定的下降，维生素B2在碱、氧化及光照破坏后峰面积有一定的下降。结果表明复方肝浸膏片不耐酸碱，易氧化，避光，应在阴凉处保存。

2.8重复性试验

精密称取批号为1312161的复方肝浸膏片3片量，按供试品溶液制备方法操作制备样品溶液共6份，测定峰面积并计算其含量，结果样品中维生素B1含量为473.00 μg/g(RSD=0.75%)；维生素B2含量为94.71 μg/g(RSD=1.24%)，表明该试验方法重现性较好。

A.对照品；B.供试品；C.阴性空白；1.维生素B2；2.维生素B1A.reference substance; B.test samples; C.negative blank; 1.vitamin B2; 2.vitamin B1图1　高效液相色谱图Fig 1　HPLC chromatogram

2.9加样回收率试验

精密称取已知含量的供试品(批号1312161)1.5片量，置于10 ml容量瓶中，再精密加对照品储备溶液0.8、1.0、1.2 ml 制成含已知对照品80%、100%、120%浓度，按供试品溶液方法制备加样回收溶液，测定并计算各个物质回收率，结果见表1。

表1　加样回收实验结果(n=6)

2.10检测限与定量限

取“2.4线性关系考察”项下的已知低浓度的混合标准溶液，精密量取10 μl注入液相色谱仪，测出各标准物质较低浓度下的信噪比S/N，计算出当S/N为3时的各标准物质的浓度，以信噪比(S/N=3)时测得维生素B1及维生素B2的仪器检出限分别为0.183 7、0.061 6 ng，以信噪比(S/N=10)时测得仪器定量限分别为0.612 6、0.205 4 ng。

2.11样品含量测定

取临汾奇林药业有限公司生产的不同批号样品3批，分别同“2.2.2”供试品溶液制备项下制备，并按上述条件测定记录色谱图并计算各自的含量，结果见表2。

表2　含量测定结果(n=3，%)

3　讨论

早在1989年就有学者对此片剂处方配伍及其疗效存有异议，认为本片剂处方设计欠合理，疗效不确，建议予以淘汰[12]。直到现在国家药监局完整登记的企业有48家，并且批有国药准字号，在市场上能满足消费者的需求，说明该品种药有存在的价值。

维生素B1、维生素B2对照品用有机溶液溶解，在紫外波长200～400 nm的扫描图谱266 nm、228 nm附近都有强吸收，选择266 nm作为检测波长。

处方中用有机相即甲醇-乙腈-0.02 mol/L庚烷磺酸钠溶液(含1%三乙胺，用磷酸调节pH至5.5)(V∶V∶V=9 ∶9 ∶82)作为流动相，其余系统适用性一致时，洗脱时间长，出峰慢导致峰形矮胖，先洗脱的维生素B2理论板数低，既浪费时间又浪费流动相，所以在有机相的基础上添加9%甲醇作为流动相，洗脱时间短，峰形高瘦，理论板数高，效果好。

维生素B2又称核黄素,是橙黄色结晶体,280 ℃时熔化分解,对空气、热、酸稳定,对光敏感,受到光的照射时易分解,易溶于酸,在碱性溶液中受光线的照射很快转化为光黄素，需避光操作[13-14]。

处方中含有干酵母，每克约含维生素B10.1～0.2 mg、维生素B20.4～0.6 mg，故将其干酵母去除后制备阴性溶液。在测定其含量时维生素B1仅能达到约90%，而维生素B2更低至53%，说明厂家投料不足或者在贮存过程中未注意保存方法而发生降解，本方法可促使厂家重视而改进工艺及包装，为人们的健康保驾护航。

综上所述，本研究的方法方便快捷、准确可信，可作为复方肝浸膏片的补充质量控制方法。

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Content Determination of Vitamin B1, Vitamin B2in Compound Hepar Extractum Tablets by HPLC

ZENG Yumei

(Dept.of Chemistry, Meizhou Institute for Food and Drug Control, Guangdong Meizhou, 514071, China)

OBJECTIVE：To establish a method for the content determination of Vitamin B1, Vitamin B2in the Compound hepar extractum tablets. METHODS: HPLC method was adopted, the chromatographic column was SHIMADZU shim-packVP-ODS(250 mm×5 mm, 4.6 μm), the mobile phase was methanol-organic solution(V∶V=9 ∶91), the determine wavelength was 266 nm, with flow rate of 1.0 ml/min. RESULTS: Vitamin B1had a good linearity in the range of 7.65-153.15 μg/ml and Vitamin B2was 2.54-50.85 μg/ml. The regression equation of Vitamin B1wasY=94.16X+10.34,r=1.000, and Vitamin B2wasY=34.22X+29.61,r=1.000. The average recovery rates were accord with the requirements. CONCLUSIONS: The method is simple, fast and accurate, and can be used as the quality control method of Compound hepar extractum tablets.

Compound hepar extractum tablets; Vitamin B1; Vitamin B2; Content determination

R927.2

A

1672-2124(2016)08-1070-03

10.14009/j.issn.1672-2124.2016.08.024

2015-12-09)

*副主任药师。研究方向：药品质量评价与标准研究。E-mail：may011499@163.com