不同浓度白术多糖及培养温度对牛卵母细胞体外成熟的影响

樊敏欢　许丹宁　田允波

（1.广东科贸职业学院人文外语系，广东广州 510430；2.广东省水禽健康养殖工程技术研究中心，广东广州 510225；3.广东省水禽健康养殖工程技术研究中心，广东广州 510225）

不同浓度白术多糖及培养温度对牛卵母细胞体外成熟的影响

樊敏欢1许丹宁2田允波3

（1.广东科贸职业学院人文外语系，广东广州 510430；2.广东省水禽健康养殖工程技术研究中心，广东广州 510225；3.广东省水禽健康养殖工程技术研究中心，广东广州 510225）

据大量学者研究表明中药多糖对细胞的生长、分化及增值都具有明显的促进作用。本试验试图通过在牛卵母细胞体外成熟培养液中加入不同浓度梯度的白术多糖溶液，进而对卵母细胞进行体外成熟培养，从中研究不同浓度白术多糖对卵母细胞体外成熟效果的影响，结果发现低剂量：10～50μg/ml白术多糖对牛卵母细胞体外成熟有促进作用；中剂量：50～100μg/ml白术多糖对牛卵母细胞体外成熟作用不明显；高剂量：150～200μg/ml白术多糖严重抑制牛卵母细胞的成熟，甚至使卵母细胞细胞质皱缩。其二试验通过提高卵母细胞的培养温度探索白术多糖对卵母细胞热应激的作用，结果发现最适浓度白术多糖对卵母细胞高温培养有一定的保护作用。

牛卵母细胞；白术多糖；体外成熟；热应激

1 试验材料与方法

1.1试验材料

1.1.1卵巢：取自佛山大沥锦丰屠宰场的健康屠宰山羊

1.1.2GV期卵母细胞：通过挖卵法取得牛GV期卵母细胞。

1.1.3主要试剂及耗材：

生理盐水（苏州海博生物技术有限公司）

磷酸盐缓冲液（PBS）、双抗、M-199基础培养液、胚胎水（赛默飞世尔生物化学制品（北京）有限公司）

发情期山牛血清、胎牛血清、液体石蜡、右旋葡萄糖（广州蕊特生物科技有限公司）

促黄体素、促卵泡素、透明质酸酶（广州莱德尔生物科技有限公司）

丙酮酸钠（广州鑫邦生物科技有限公司）

80 % 白术多糖（批号：TY20120823）（西安天园生物制剂厂）

以下试剂均购自Sigma公司：胚胎水、NaCl（Sigma S5886）、KCl（Sigma P5405）、NaHCO3（Sigma S5761）、NaH2PO4 H2O （Sigma S9638）、Hepes（Sigma H9136）、Na Lactate（Sigma L1375）、Phenol Red solution（Sigma P0290）、CaCl2·2H2O （Sigma C7902）、MgCl2·6H2O（Sigma M2393）、3 %牛血清蛋白（BSA）（Sigma 4503）

0.22μm针头过滤器、35 mm细胞培养皿、离心管、10 ml注射器、无菌手套、口罩、帽子等实验室常规器械及耗材。

1.2试验方法

1.2.1卵母细胞洗涤液及基础成熟培养液配制

（1）洗涤液：TL-Hepes液。

（2）卵细胞成熟培养液：TCM199+0.5496 g/L右旋葡萄糖+0.1 g/L丙酮酸钠+0.075 g/L青霉素+0.05 g/L链霉素+10 μg/ml FSH+10 μg/ml LH +10 %发情期山牛血清（牛卵母细胞）（或10 %胎牛血清（牛卵母细胞）），调节pH值为7.2～7.4。

1.2.2牛卵母细胞的采集方法

卵母细胞的采集直径>2 mm 的卵泡采用注射器抽吸法，直径＜2 mm 的卵泡采用挖卵针取卵法，收集50个左右的卵泡置于含有1.5ml TL-Hepes液的无菌培养皿中，在体视显微镜下检取卵丘-卵母细胞复合体，选择 A/B 级卵母细胞用于试验。

1.2.3卵母细胞培养前洗涤方法

采用微滴法洗涤卵母细胞：35 mm无菌细胞培养皿上，先滴入20μl成熟培养液，覆盖液体石蜡2.5 ml，在原液滴上追加70μl成熟培养液，微滴总量为90μl，每个培养皿上可放置4个微滴，38.5 ℃、5 % CO2环境孵育4～6 h后备用。

卵母细胞从卵巢取出后，显微镜下挑选出A/B级卵母细胞，分别用TL-Hepes微滴洗涤5次，TCM199微滴洗涤5次。

1.2.4白术多糖原液配制方法

准确称取80 % 白术多糖12.5mg，溶于10 ml胚胎水中，充分混匀，0.22 μm过滤器过滤灭菌，配制成1 mg/ml的白术多糖原液分装备用（有效期1个月），用时按需要进行稀释。

1.2.5卵母细胞培养方法

采用大微滴法对卵母细胞进行培养：35 mm无菌细胞培养皿上，先滴入40μl成熟培养液，覆盖液体石蜡2.5 ml，在原液滴上追加140 μl成熟培养液，微滴总量为180μl，每个培养皿上放置2个微滴。38.5 ℃、5 % CO2环境孵育4～6h备用。

选取洗涤后的A/B级卵母细胞，用捡卵针移入预平衡4～6h 的成熟培养液微滴内进行培养，5 % CO2，相对湿度95 %；24～26 h（牛卵母细胞）后取出观察结果。

1.2.6卵母细胞成熟判断方法

将培养20～22h后的卵母细胞移入含有0.2 %透明质酸酶的PBS液中，作用1～2min后，用捡卵针反复吹打，去掉卵母细胞表面包裹的卵丘细胞，用基础成熟培养液洗涤3次，观察裸露的卵母细胞，以排出第一极体作为成熟的判定标准，于显微镜下计算成熟数及成熟率。

1.3试验分组设计

1.3.1不同浓度白术多糖对牛卵母细胞体外成熟培养的影响试验

试验共分6组，第1组为对照组，卵母细胞成熟培养液成分：基础成熟培养液+10 μg/ml FSH+10 μg/ml LH；第2～6组为白术多糖组，卵母细胞成熟培养液成分：基础成熟培养液+10 μg/ml FSH+10 μg/ml LH +（低剂量：10μg/ml、50μg/ml，中剂量：100μg/ml，高剂量：150μg/ml、200μg/ml）白术多糖溶液，具体分组情况如表1所示。

表1　试验组成熟培养液成分

表2　试验组培养温度变化

1.3.2白术多糖对牛卵母细胞体外成熟高温培养的影响试验

试验共6个小组，每小组设置一个对照组及一个试验组。6个小组的对照组的成熟培养液成分为卵细胞成熟培养液 +0 μg/ml白术多糖，而试验组的成熟培养液成分为卵细胞成熟培养液 +50 μg/ml白术多糖。分别改变牛卵母体外培养温度，具体分组情况如下：

2　结果与分析

2.1不同浓度白术多糖对牛卵母细胞体外成熟培养的影响试验

表3　不同浓度的白术多糖对牛卵母细胞体外成熟率的影响

对369个牛卵母细胞进行体外成熟培养，试验结果（3）显示：添加浓度为50 μg/ml时，卵母细胞成熟率最高，显著高于200μg/ml剂量组（P＜0.05），但与对照组及其他浓度剂量组差异不显著（P>0.05），添加浓度为200μg/ml时，卵母细胞体外成熟率是所有试验组中最低的，与对照组差异显著（P＜0.05）。从整体上看，中、低浓度的白术多糖对牛卵母细胞体外成熟均有较好的促进作用，在100μg/ml时，仍能维持较高的成熟效率，150 μg/ml时虽然成熟率开始下降，但与对照组间无显著性差异（P>0.05），可见，牛卵母细胞对白术多糖添加浓度的变化耐受范围较宽。同时可以看出，牛卵母细胞对白术多糖浓度的依赖性较强，仅低浓度的白术多糖可以提高卵母细胞的成熟率，而中、高剂量的白术多糖对卵母细胞的体外成熟均有不同程度的抑制作用；牛卵母细胞在中、低浓度的白术多糖培养液中，体外成熟率较对照组有所提高，仅在高剂量添加时，才对卵母细胞的成熟有所抑制。200μg/ml的白术多糖培养液牛卵母细胞出明显的抑制作用进而导致卵母细胞严重萎缩死亡，这表明白术多糖对卵母细胞体外成熟的促进作用是有明显的剂量依赖性，并非越多越好，这与培养液成分的相互作用有关。

2.2白术多糖对牛卵母细胞体外成熟高温培养的影响试验

在不同浓度的白术多糖对牛卵母细胞体外成熟率的影响的试验中，初步测得牛卵母细胞体外成熟培养的最适浓度为50 μg/ ml。本试验试图提高卵母细胞体外培养温度，人工制造热应激，试图探索白术多糖对卵母细胞体外高温培养有无保护作用。试验结果（表4）显示：培养温度为38.5℃时，卵母细胞成熟率较其他试验组高，当温度上升0.5℃时，对照组牛卵母细胞体外成熟率为0%而添加50μg/ml 白术多糖试验组牛卵母细胞的成熟率为16.68%。当温度上升39.5℃时，对照组牛卵母细胞体外成熟率为0%而添加了50 μg/ml 白术多糖试验组牛卵母细胞的成熟率为0.05%。但温度高于40℃，无论是试验组还是对照组均未见卵母细胞成熟。可见白术多糖在卵母细胞体外培养中产生了一定的过热保护作用，大量研究文献得出牛卵母细胞体外培养温度为38.5℃，但在培养液中加入50 μg/ml的白术多糖能拓宽牛卵母细胞体外培养温度使之能有+0.5～1℃的温度差范围。但是培养温度过高时，本试验认为高40℃，白术多糖对牛卵母细胞体外成熟培养的保护受抑制，这可能是由于温度过高是的细胞内酶失去生物活性，从而导致卵母细胞死亡。

3 小结

补益类中药多糖具有控制细胞分裂、分化、调节细胞生长、衰老的功能，对细胞也有不同程度的保护作用［1-3］。本研究选用白术多糖作为添加物，对牛卵母细胞进行体外培养，旨在探讨白术多糖对卵母细胞发育的调控作用，为优化卵母细胞培养体系提供试验依据。

表4　白术多糖对牛卵母细胞体外成熟高温培养的影响试验

3.1不同浓度白术多糖对牛卵母细胞体外成熟培养的影响试验

目前，哺乳动物卵母细胞成熟培养液均以M-199为基础培养液，添加生殖激素、血清、生长因子及其他营养成分。成熟培养液的成分根据培养卵母细胞的种类稍有差异。本试验在培养液中加入含有发情期牛（或胎牛）血清，其目的是由于发情期牛的血清中含有多种出尽卵细胞成熟的激素，添加同源性血清卵母细胞的离体成熟及发育具有重要作用。本试验还添加低剂量（10、50 μg/ml）、中剂量（100 μg/ml）及高剂量（150、200 μg/ml）的白术多糖溶液，观察不同白术多糖添加浓度对卵母细胞发育能力的作用，综合试验结果得出，于高剂量白术多糖均表现出发育停滞现象，尤其是添加剂量为150 μg/ml以上时，卵母细胞的成熟率显著下降，镜检观察到大部分卵母细胞出现了皱缩现象，说明高浓度的糖类物质，可能会导致成熟培养液渗透压发生变化，细胞内水分流失，胞质皱缩，出现发育受阻现象。

有研究人员发现葡萄糖为营养物质培养卵母细胞，高浓度（11.2 mmol/L）葡萄糖对卵母细胞的体外成熟产生抑制，中浓度（5.6 mmol/L）的葡萄糖培养液则可使卵母细胞的成熟率提高；Fraser等分别在不同浓度梯度的 D-葡萄糖的KSOM体外培养基中培养小鼠二细胞，结果发现0.2、5.56 mmol/L培养基中二细胞胚能发育成囊胚，其他高糖浓度的则不能，结果显示高糖环境对早期着床前胚胎有抑制作用。葡萄糖作为最单纯的能量来源，其有效作用浓度应为6.0 mmol/L以下，高于此浓度，卵母细胞成熟率均有下降。这一现象可能与葡萄糖转运子（glucose transporters，GLUT）有关。GLUT1基因缺乏的胚胎较野生型胚胎的细胞凋亡率要高，畸形胚胎率也高.。糖尿病模型雌鼠早期胚胎细胞中GLUT1、2、3的表达下调，体外培养亦显示二细胞在高浓度（30、52 mmol/ L）糖培养液中培养72 h，GLUT的mRNA和蛋白表达水平均明显减少，由于 GLUT的减少使高糖环境下细胞对葡萄糖摄取减少，内部游离血糖水平降低，细胞得不到足够能量，可能是细胞停滞发育的另一个重要因素。

3.2白术多糖对牛卵母细胞体外成熟高温培养的影响

卵母细胞在体外继续发育对生长环境要求非常严格，温度、气相、培养液的pH值、移动的次数等均可影响卵母细胞的发育能力，本研究采取升高环境温度的手段，对卵母细胞造成人为有害刺激，以此观察白术多糖对卵母细胞成熟的保护作用，试验结果证实，对于牛卵母细胞，但温度高于39℃，卵母细胞大多停滞发育，但通过在培养液中加入50 μg/ml的白术多糖，能够很好地保护卵母细胞免受热应激的影响。在温度为38.5～39.5℃时，试验组仍有卵母细胞成熟，这表明白术多糖对于牛卵母细胞抵抗不良环境的能力作用更加显著。

［1］毛健，马海乐.灵芝多糖的研究进展［J］.食品科学，2010，31 （1）：295-299.

［2］吴梅，谭睿.黄芪多糖研究进展［J］.川北医学院学报，2013，28 （1）：17-22.

［3］田允波，许丹宁，黄运茂，等.白术多糖免疫调控作用的研究进展［J］.畜牧与兽医，2010，42（9）：98-100.

杨琪（1994—），女，本科，研究方向：预防兽医。