猪流行性腹泻疫苗免疫母猪后哺乳仔猪免疫效果ELlSPOT和ELlSA检测

李凯航周鑫焱杨显超吴秀娟王 建*

（1.上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103；2.扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 225009）

猪流行性腹泻疫苗免疫母猪后哺乳仔猪免疫效果ELlSPOT和ELlSA检测

李凯航1周鑫焱2杨显超1吴秀娟1王 建1*

（1.上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103；2.扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 225009）

猪流行性腹泻（porcjne epjdemjc djarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcjne epjdemjc djarrhea vjrus，PEDV）引起的猪的一种急性接触性肠道传染病，以呕吐、腹泻、食欲下降和脱水为基本特征，各年龄段均易感染，尤以哺乳仔猪受害最重。本论文通过调查上海本地PED的流行情况，用市场上现有的主要PED疫苗免疫母猪，对窝产仔猪进行连续的免疫反应监测，观察其体液免疫和细胞免疫的变化，结合之前监测结果对疫苗免疫效果进行评估，为猪场筛选合适疫苗，制定合理的免疫程序，预防与控制PED提供理论依据。

猪流行性腹泻；体液免疫；细胞免疫；免疫评估

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus）PEDV所导致的，PEDV是属于套式病毒目（Nidov hales）冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒亚科（Coronav irinae）甲型冠状病毒属（Alphacoronavirus）b亚群的成员。感染猪主要临床体现为水样腹泻、呕吐和脱水，不同年龄、品种的猪均易感染，对哺乳仔猪的危害尤其严重。

在PED近年来的综合防治措施中，母猪返饲和“换奶妈”，猪圈烘干等措施效果时好时坏，百家争鸣，褒贬不一，当前，随着国内PED变异株细胞培养难关的攻克，该病防治的焦点又重回疫苗的生产上，但因细胞培养产生的病毒浓度无法达到生产工艺要求，变异株疫苗尚无商品化疫苗供应。养殖户迫于疫病防控压力，从多种途径采购美国进口苗、韩国进口苗、国内厂家正规疫苗甚至无批号的“白板苗”，免疫次数从二免到七免都有，但疫苗免疫效果缺少评价。本研究采集上海本市规模化猪场母猪、育肥猪和仔猪的血清作为实验样品，使用商品化的试剂盒检测哺乳仔猪血清中的ELISA抗体和外周血细胞（PBMC）中的γ-干扰素水平，从体液免疫和细胞免疫两方面对免疫效果加以评估，希望客观反映疫苗免疫效果。

1 材料和方法

1.1样品采集

首先对上海市规模猪场采集的血清样品进行ELISA抗体摸底调查，样品均采自本市各区县猪场。对存栏母猪和育肥猪通过前腔静脉无菌采集血液，侧放静置30min，待析出血清后，2000 rpm离心10min，分离血清装入1.5 ml EP管冻存待检。

随后，选择无流行性腹泻感染史的猪场，挑选10只头胎母猪，经PCR方法检测无疫后分成2组。免疫组：6头母猪产前按照免疫程序（产前2月和产前1周）进行两次免疫，首免为ZY灭活疫苗，二免为DBN弱毒疫苗，2头母猪为对照组，不免疫PED疫苗。母猪产仔后对窝产哺乳仔猪进行检测，检测时间为产后3 d、6 d、9 d、12d、16 d、19 d和26 d，仔猪每次随机挑选5只同步采集血清和全血（肝素钠为抗凝剂），分别进行ELISA和ELISPOT检测。

1.2试剂及仪器

1.2.1ELISA试剂及仪器

ELISA检测试剂盒购自Biovet公司，批号：153007，TECAN SUNRISE酶标仪。

1.2.2ELISPOT试剂及仪器

ELISPOT试剂盒购自MABTECH公司，批号：3130-4HPW-2。LSM（Lymphocyte Separation Medium）淋巴细胞分离液和植物血凝素（Phytohemagglutinin）购自MP公司，细胞培养的PEDV（2*105TCID50）由实验室保存，CTL Analyzers LLC ELISPOT计数仪。

1.3实验方法

1.3.1ELISA检测

按照Biovet公司ELISA试剂盒说明书操作。

1.3.2ELISPOT检测

淋巴细胞分离、孵育及检测参照MABTECH试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1规模猪场免疫效果调查

对2014-2015年本市5个区县37个规模猪场的1100头母猪和710头育肥猪进行PED免疫效果ELISA检测，全市PED免疫后，母猪的免疫平均合格率为50.1%，而育肥猪仅为36.4%，母猪的免疫水平明显高于育肥猪。各区县母猪免疫合格率介于26.7～63.3%，育肥猪免疫合格率介于18.3～42.5%，均未能达到70%的免疫合格线。2015年与2014年检测结果类似，免疫整体水平母猪群高于育肥猪群，各区县母猪免疫合格率介于30.0～48.8%，育肥猪合格率介于11.67～31.25%，整体免疫合格率母猪为38.73%，育肥猪为21.13%，整体免疫合格率与2014年同比降低。

2.2血清ELISA检测结果

利用ELISA方法来检测猪流行性腹泻疫苗免疫母猪后窝产仔猪免疫效果，挑选了6头实验母猪，每头母猪挑选5只仔猪进行母源抗体检测，以同一母猪的窝产哺乳仔猪检测后的S/P均值为线作图1。

图1　实验仔猪PED母源抗体变化

从图1中可以看出，仔猪在出生后母源抗体一直处于下降趋势，免疫合格判定临界值为S/P值等于0.5，而67%的窝产仔猪在第9 d时即抗体转阴，16%的仔猪在9～16 d内抗体转阴，所有仔猪在19 d后ELISA抗体均已转阴。由此可知，猪流行性腹泻疫苗免疫母猪后窝产仔猪免疫效果并不理想，仔猪依然面临着PEDV感染风险。

2.3全血ELISOPT检测结果

ELISPOT检测实验仔猪全血样本，斑点数的多少代表的是仔猪细胞淋巴细胞的特异性免疫分泌的γ-干扰素多寡，窝产仔猪斑点数在0-40之间，阳性斑点在52-179之间。

图2　ELISPOT阳性对照斑点图

图3　ELISPOT阴性对照斑点

不同日龄和对照组一共8组数据，为更准确的判断出仔猪PED的免疫状况，借助SPSS软件对数据进行分析，将对照组数据作为分析对照，利用LSD法判断显著性。均值差的显著性水平为0.05，置信区间95%的前提下，日龄为9、12、16d的窝产仔猪的ELISPOT斑点数均值差与对照组相比存在一定差异，差异不显著，说明在细胞免疫水平上并没有取得理想的免疫效果。

3 结论

运用ELISA方法对上海市规模化养猪场的生产母猪群和育肥猪群进行监测，从抗体免疫水平来看，2014-2015年所监测的37个规模猪场，场合格率仅为5.4%（2/37）。其中，2014年生产母猪群体免疫合格率为50.1 %，育肥猪群36.4 %；2015年生产母猪群群体免疫合格率为38.7%，育肥猪群为21.1 %。免疫合格率生产母猪高于育肥猪0.75 %-32.8 %不等。从本市PED总体免疫效果来看，连续两年的监测均远远低于70%免疫合格线，对病毒无法起到阻断传播作用，容易造成病毒流行散播，一旦出现极端天气、消毒不良、饲养不规范等诱因，极易造成发病，PED体液免疫效果亟待提升。2014年与2015年免疫效果相比较，2015年母猪和育肥猪群免疫合格率均出现显著下降，这一方面可能是猪场未能按照正常的免疫程序免疫，免疫积极性下降，另一方面，是现有的疫苗无法对其起到应有的效果。

本实验分析的样本均采用了目前本市规模化猪场普遍采用的免疫形式，即对待产母猪进行两次免疫，首免在母猪妊娠中期使用灭活苗，二免在母猪妊娠晚期使用弱毒苗的免疫方式，观察新生仔猪体液免疫消长规律，以此来对疫苗免疫效果进行评估。对3-26d的窝产仔猪母源抗体进行了监测，结果显示母源抗体会在仔猪在出生后迅速下降，所有仔猪在19天后ELISA抗体均已转阴。PED多侵袭0-9日龄仔猪，在实验中，67%的窝产仔猪在第9 d 时抗体转阴，不再受到免疫保护，这对于仔猪来说是十分危险的。

在评价细胞免疫效价时，应当建立检测评价细胞免疫的如ELISPOT等方法。IFN-γ是由Th1细胞亚群分泌的一类细胞因子，其ELISPOT 检测方法可以作为检测和评价疫苗细胞免疫的有效方法。为此，我们选定试验母猪产前免疫疫苗，对新生仔猪开展了IFN-γ ELISPOT 方法检测，检测发现，仔猪IFN-γ实验数据在9-16日龄的监测数据与对照组产生了一定差异，但差异不显著，说明PED疫苗免疫后，新生仔猪在此阶段不产生强烈的Th1细胞免疫反应，综上所述，母猪产前免疫灭活+弱毒进行两次免疫的疫苗注射方式无法产生强力的体液和细胞反应，这应与疫苗的毒力效价不足有关。

［1］杜晓莉.浙江省猪流行性腹泻病毒S1基因变异及间接ELISA的建立［D］.甘肃农业大学，2014.

［2］郭璇.猪流行性腹泻病毒的分离及间接ELISA的建立［D］.广西大学，2013.

［3］卫龙兴，成建忠.上海规模化猪场猪病毒性腹泻的流行病学调查［J］.畜禽业，2010，（259）：60-61.

沪农科攻字（2013）第5-5号；沪农科产字（2016）第6号

王建

李凯航（1977—），男，高级兽医师，主要从事动物疫病防治工作。