AKT1基因rs1130214位点基因多态性与原发性肝癌的病例对照研究

田　莉, 谢惠芳, 孙高峰,2

(1新疆医科大学公共卫生学院， 乌鲁木齐　830011; 2乌鲁木齐市疾病预防控制中心， 乌鲁木齐　830026)



AKT1基因rs1130214位点基因多态性与原发性肝癌的病例对照研究

田莉1, 谢惠芳1, 孙高峰1,2

(1新疆医科大学公共卫生学院， 乌鲁木齐830011;2乌鲁木齐市疾病预防控制中心， 乌鲁木齐830026)

目的探讨AKT1基因rs1130214位点基因多态性与原发性肝癌的关系。方法采用病例对照法，选择原发性肝癌患者127例(病例组)、肝癌高危者81例(内对照组)、健康体检者103例(外对照组)，采用聚合酶联反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测AKT1基因rs1130214位点的基因多态性。结果病例组AKT1基因rs1130214位点等位基因G和T的频率分别为76.8%(195/254)和23.2%(59/254)，内对照组分别为68.1%(109/160)和31.9%(51/160)，外对照组分别为62.1%(128/206)和37.9%(78/206)。3组各等位基因分布差异有统计学意义(χ2=11.7,P=0.003)。病例组rs1130214基因型分布纯合子TT型、野生型GG型、杂合子GT型分别为3例(2.3%)、71例(55.9%)和53例(41.7%)；内对照组中为4例(5.0%)、33例(41.3%)和43例(53.8%)，外对照组为9例(8.7%)、34例(33.0%)和60例(58.3%)，3组各基因型分布差异有统计学意义(χ2=14.7,P=0.005)。Logistic回归分析发现与野生纯合子GG基因型相比，发生肝癌的概率为2.54倍(OR=2.41，95%CI:1.48～4.35)，为原发性肝癌的易感基因。结论AKT1基因rs1130214位点基因多态性可能与原发性肝癌的发生有关，突变基因型(GT+TT)可能是原发性肝癌的易感基因。

原发性肝癌； AKT1； 基因多态性

原发性肝癌(primary hepatic carcinoma，PHC)是发生于肝实质细胞或肝内胆管上皮细胞的癌症，其恶性程度高，生存期短，严重威胁着患者的生命健康，5年生存率仅为3%～5%[1]。我国每年被诊断为原发性肝癌的病例占世界新发病例的55%，肝癌已经成为严重威胁人类生命的恶性肿瘤之一[2]。流行病学和病因学研究表明AKT1基因与肿瘤的发生有关[3-5],同时也有研究指出AKT在肝癌中有异常表达[6-7]。本研究采用病例对照研究方法，探讨PHC发病与AKT1(rs1130214)的关系，以期为PHC的防治工作提供科学依据。

1　资料与方法

1.1研究对象选择新疆医科大学肿瘤附属医院2014年6月-2015年6月首次住院治疗原发性肝癌患者127例(病例组)，其中男性101例(79.5%)，女性26例(19.4%)，平均年龄(54.95±9.66)岁。肝癌患者的诊断依据为中国抗癌协会最新公布的肝癌诊断标准[8]。选取经国家癌症早诊早治项目筛查确定为肝癌高危者81例(内对照组)，其中男性52例(64.2%)，女性29例(35.8%)，平均年龄(53.83±7.70)岁。选取同时期新疆医科大学肿瘤附属医院体检科参加健康体检者103例(外对照组)，其中男性81例(78.6%)，女性22例(21.4%)，平均年龄(5.13±7.90)岁。外对照组均无任何肝病史及肿瘤史。所有样本均知情同意。

1.2研究方法

1.2.1基因组提取采集患者外周血1 mL，加入5%EDTA抗凝，—80℃冰箱保存备用。基因组提取采用天根全血基因组提取试剂盒，提取步骤按说明书操作。

1.2.2PCR反应体系及条件rs1130214位点上游引物5’-GTGCTCCTCACTGACGGACT T-3’，下游引物5’-AGCCTCCCTAACCTGATGCAC-3’参考自文献[9]，由华大基因合成。PCR总反应体系25 μL：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、DNA模板0.5 μL、ddH2O 11 μL。聚合酶链式反应(PCR反应)条件:预变性93℃ 3 min，扩增包括变性93℃ 30 s，退火64℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，扩增循环数30次；再延伸72℃ 5 min。取产物6 μL于2%EB染色琼脂糖凝胶电泳检测，扩增产物大小为465 bp。

1.2.3 酶切体系及条件取PCR产物10 μL，分别加入1×NE Buffer 5 μL，限制性内切酶Xcm I 10 units(2 μL)，ddH2O 33 μL，总体系50 μL,恒温水浴60 min。

1.3统计学处理采用SPSS 17.0统计软件包处理数据，AKT1各基因型及基因频率的分布采用χ2检验，各基因型与肝癌相关性分析采用Logistic回归分析，采用双侧概率检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1AKT1基因rs1130214位点酶切结果AKT1基因rs1130214位点酶切后野生纯合子GG基因型出现2个条带(289 bp+167 bp),突变纯合子出现1个条带TT(456 bp),突变杂合子GT基因型出现3个条带(456 bp+289 bp+167 bp)，取酶切产物6 μL于3%EB染色琼脂糖凝胶电泳检测，见图1。

2.2AKT1基因rs1130214位点基因型及等位基因分析3组rs1130214位点基因型频率分布符合hardy-weinberg平衡检验(P>0.05)，病例组中AKT 1基因野生型GG 71例(55.9%)，纯合子TT 3例(2.3%)，杂合子GT 53例(41.7%)；内对照组中，野生型GG 33例(41.3%)，纯合子TT 4例(5.0%)，杂合子GT 43例(53.8%)，外对照组野生型GG 34例(33.0%)，纯合子TT 9例(8.7%)，杂合子GT 60例(58.3%)，3组各基因型分布差异有统计学意义(χ2=14.7，P=0.005)，见表1。病例组等位基因G和T的频率分别为76.8%(195/254)和23.2%(59/254)，内对照组分别为68.1%(109/160)和31.9%(51/160)，外对照组分别为62.1%(128/206)和37.9%(78/206)。3组等位基因分布差异有统计学意义(χ2=11.7,P=0.003)，见表2。

表1AKT1基因rs1130214位点Hardy-Weinberg检验及基因型分布/例(%)

分组例数AKT1基因rs1130214基因分型GGTTGTχ2P值病例组12771(55.9)3(2.3)53(41.7)内对照组8133(41.3)4(5.0)43(53.8)14.70.005外对照组10234(33.0)9(8.7)60(58.3)

表2　AKT1基因rs1130214位点等位基因分布/例(%)

2.3AKT1基因rs1130214位点Logostic回归分析以内对照组和外对照组为因变量，与野生纯合子GG基因型相比，突变基因型(GT+TT)发生肝癌的概率为1.38倍(OR=1.38，95%CI:0.75～2.52)，差异无统计学意义。以病例组和外对照组为因变量，二元Logiestic 回归分析显示，与野生纯合子GG基因型相比，突变基因型(GT+TT)发生肝癌的概率为2.54倍(OR=2.41，95%CI:1.48～4.35)，差异有统计学意义，见表3。

表3　AKT1基因rs1130214位点Logostic回归分析

3　讨论

原发性肝癌的发生机制复杂，有明显的家族聚集现象， 其本质是因为遗传因素和肝癌之间存在着相关性。由于遗传学和表观遗传学改变而引起原癌基因活化和抑癌基因灭活是导致肝癌发生的关键过程。有研究发现人体内存有导致肝癌的易感基因[10]。因此研究肝癌相关易感基因成为了人类了解肝癌的又一方向。

AKT作为PI3K/AKT 信号通路的下游调控因子，在细胞稳态的维持和分化中起作用[11]。AKT经PI3K活化后生成磷酸化AKT(p-AKT)发挥促肿瘤细胞生存、促进细胞周期行进以及促生长作用，是PI3K/AKT 信号通路的核心效应[12]。Kim 等[13]认为AKT基因多态性与早期非小细胞型肺癌的预后有关。Piao等[14]的研究表示AKT基因多态性与胃癌发生有关。抑制AKT信号通路的活化，就能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡，从而抑制肿瘤生长。李一春等[15]研究表明通过抑制AKT 蛋白磷酸化发挥作用可抑制肝癌hepG-2细胞增殖。根据以上报道，推测AKT1基因多态性与原发性肝癌的发生可能有密切的关系，目前国内AKT1基因与原发性肝癌的研究多停留在其蛋白异常表达的研究，鲜有该基因多态性与原发性肝癌关联性的研究，因此进一步研究与探讨AKT1基因在肝癌中的作用及机制是非常必要的。本研究选择AKT1 rs1130214突变位点，分析该位点基因多态性与新疆地区人群原发性肝癌遗传易感性的关联。结果显示：病例组、内对照组和外对照组间该位点基因型和等位基因频率分布差异均有统计学意义，表明AKT1 rs1130214位点的基因多态性可能与新疆地区人群原发性肝癌发病有关联。基因型Logistic回归分析显示，突变基因型(GT+TT)可能为原发性肝癌发生的易感基因型，这将有助于筛选肝癌高危人群或易感个体，并为个性化的癌症诊治提供依据。本研究结果仍需完善实验设计方案的大样本量的、研究对象的人群代表性较高的研究进行进一步的深入探索和验证。

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(本文编辑施洋)

Case-control study of primary hepatic carcinoma and rs1130214 of AKT1 gene polymorphism

TIAN Li1, XIE Huifang1, SUN Gaofeng1,2

(CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China;CenterforDiseaseControlandPrevention,Urumqi830026,China)

ObjectiveTo investigate the relationshaps between AKT1 gene polymorphism and primary hepatic carcinoma. MethodsIn the case-control study, 127 cases of primary hepatic carcinoma patients were enrolled as case group, 81 cases with high risk factor of hepatic carcinoma as intra-control and 103 case of health people as extra-control. PCR-RFLP was used to detect the gene polymorphism of AKT1 of rs1130214. ResultsIn the cases group, the frequency of the alleles G and T of AKT1 of rs1130214 were 76.8%(195/254) and 23.2%(59/254), 68.1%(109/160) and 31.9%(51/160) in the intra-control group, 62.1%(128/206) and 37.9%(78/206) in the extra-control group, respectively, and the differences of allele distribution between the three groups was statistically significant (χ2=11.7, P=0.003). In the case group, the genotype distribution of rs1130214 in homozygote TT, wild type GG and heterozygote TG were 3(2.3%), 71(55.9%) and 53(41.7%) respectivily. In the intra-control group were 4(5.0%), 33(41.3%) and 43(53.8%) respectivily. In the extra-control group were 9(8.7%), 34(33.0%) and 60(58.3%) respectivily, and the difference the of genotype distribution among the three groups was statistically significant (χ2=14.7, P=0.005). Logistic regression analysis found that mutation genotype (GT+TT) was the risk factor of primary hepatic carcinoma (OR=2.41, 95%CI:1.48～4.35), compared with wild homozygous GG genotype. ConclusionThe gene polymorphism of AKT1 of rs1130214 may be associated with the occurrence of primary hepatic carcinoma and mutation genotype (GT+TT) may be the risk factor of primary hepatic carcinoma.

primary hepatic carcinoma; AKT1; gene polymorphism

乌鲁木齐市科技计划项目(Y141310052)

田莉(1991-)，女，在读硕士，研究方向：疾病预防与控制。

孙高峰(1974-)，男，在读博士，副主任医师，研究方向：疾病预防与控制，E-mail：sgfxj2004@126.com。

R735.7

A

1009-5551(2016)06-0757-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.023

2016-1-27]