线粒体激素受体P43在甲状腺乳头状癌中的表达及其临床价值

邵国安， 李仕亮， 徐　雷， 马斌林， 祝兰华

(新疆医科大学1第五附属医院甲状腺乳腺外科， 2附属肿瘤医院甲状腺乳腺外科， 乌鲁木齐　830011)



线粒体激素受体P43在甲状腺乳头状癌中的表达及其临床价值

邵国安1， 李仕亮1， 徐雷1， 马斌林2， 祝兰华1

(新疆医科大学1第五附属医院甲状腺乳腺外科，2附属肿瘤医院甲状腺乳腺外科， 乌鲁木齐830011)

目的探讨线粒体激素受体P43(MT-P43)所在片段在甲状腺乳头状癌组织及结节性甲状腺肿组织中的转录水平及其与甲状腺乳头状癌临床病理的关系。方法采用实时荧光定量PCR法(RT-PCR)，在mRNA水平检测31例甲状腺乳头状癌和31例结节性甲状腺肿新鲜标本及其各自对应的病变旁组织中MT-P43 mRNA的转录表达情况。结果结节性甲状腺肿组织和甲状腺癌组织MT-P43 mRNA转录水平均较各自配对的病变旁组织明显上升。31例结节性甲状腺肿较其病变旁组织MT-P43 mRNA转录水平明显上升，其相对倍比关系为(3.26±0.43)，差异有统计学意义(t=4.35，P=0.000)。31例甲状腺癌较癌旁组织MT-P43 mRNA转录水平明显上升，其相对倍比关系为(4.04±0.19)，差异有统计学意义(t=3.375，P=0.001)。甲状腺癌较结节性甲状腺肿MT-P43 mRNA转录水平明显上升，其相对倍比关系为(5.52±0.30)，差异有统计学意义(t=2.040，P=0.025)。MT-P43 mRNA的转录水平与患者性别、年龄及肿瘤大小无关(P>0.05)；而与患者淋巴结转移及临床病理分期有关(P<0.05)。结论MT-P43 mRNA转录水平上升可能对甲状腺恶性病变的发生有促进作用，转录水平越高，越容易发生恶变，这对于甲状腺癌的诊断及鉴别诊断有一定的提示价值。

甲状腺癌； 结节性甲状腺肿； mt-P43； RT-PCR

世界范围内的流行病学研究指出，目前甲状腺癌发病率呈现持续上升态势[1]；全球甲状腺癌的发病率正以每年4% 的速度增长，并已跃居女性常见肿瘤的第8位[2]。在一项全世界范围内1973-2002年不同性别甲状腺癌发病率情况的调查研究显示，女性甲状腺癌发病率增加了67%，而男性甲状腺癌发病率也增加了48%[3]。

现今临床上关于甲状腺癌分子水平的研究和应用较多发生在核基因突变水平，如RET/PTC重排[5]和BRAF基因突变[6-7]。但近年来线粒体在肿瘤发生中的作用正在日益受到重视，有关研究证实三碘甲腺原氨酸T3存在独立的线粒体受体TRα(MT-P43即其片段之一)，且线粒体结构功能的异常与肿瘤的发生、发展有一定的联系，如线粒体生物氧化功能的改变、介导激活的细胞凋亡途径异常、细胞分化异常、线粒体蛋白质的合成、细胞生物合成机制等[8-9]。但该受体的相关研究多选取胰岛或肝脏功能为研究对象，对甲状腺的相关实验鲜有报道。本研究采用荧光定量PCR技术检测甲状腺癌、结节性甲状腺肿及其各自对应的病变旁组织中线粒体甲状腺激素受体P43的表达水平，旨在探讨甲状腺癌可能的发病机制，进而为甲状腺癌分子水平的诊断提供新方向。

1　资料与方法

1.1临床资料选取31例结节性甲状腺肿和31例甲状腺乳头状癌的新鲜组织标本，手术标本取自于新疆医科大学第五附属医院、新疆医科大学附属肿瘤医院及新疆医科大学第一附属医院2013-2015年手术切除并经常规病理诊断证实的结节性甲状腺肿和甲状腺乳头状癌及其两者的病变旁正常组织。所有资料完整，其中男性9例，女性22例，年龄22～69岁，平均45.7岁。本研究通过新疆医科大学第五附属医院伦理审查委员会批准,所有标本均获得患者的知情同意。

1.2试剂及方法TRNzoI Universal Reagent(货号：O3722)、琼脂糖生物试剂(货号：0000181181)、GOIdenViewTM(货号：696461BS) 6× DNA loading Buffer(货号：2826)、DAN Marker I(货号：3201)均购自北京天根生化科技有限公司(北京)，Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (货号：10842320)、FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(货号：10904600)均购自德国罗氏生物有限公司。MT-P43 mRNA转录水平检测均采用新鲜标本，RT-PCR检测。MT-P43上游引物：5′-AAGGAGGAACAGGAGACGA-3′；MT-P43下游引物：5′-CAGACGGGAAACATCTATTGG-3′；β-actin 上游引物：5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3′; β-actin 下游引物：5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′。按照Roche公司使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行总RNA反转录，步骤如下:反应体系：将dT 1 μL、Reaction Buffer 4 μL、Rnase Inhibitor 0.5 μL、dNTP 2 μL、RT 0.5 μL、Total RNA 500 ng混匀后加入ddH2O补至总体积为20 μL，离心15 s，置于PCR仪中。反应条件如下：(1)55℃ 30 min ，1个循环；(2)85℃ 5 min，1个循环；(3)反应后产物置于-20℃保存。使用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)进行RT-PCR；置于实时PCR仪中，将收集纯化后的DNA样品进行定量，按照8倍梯度稀释的方法，稀释成8支管，每管各取2 μL DNA作为模板，以MT-P43和β-actin为引物进行实时荧光定量PCR，反应体系: 将2 ХTaq PCR MasterMix 6 μL、上游引物 1 μL、下游引物 1 μL、CDNA模板 2 μL轻混匀后加入ddH2O补至20 μL后放入200 μL PCR管中，离心20 s，置于普通PCR仪器中。反应条件：(1)95℃ 10 min ，1个循环；(2)60℃ 30 s，39个循环；(3)反应后产物置于4℃保存；(5)检测荧光信号，并绘制溶解曲线。

1.3结果判定RT-PCR反应结束后记录各组的Ct值，每个样本设置3个复孔。采用相对定量法比较各组中MT-P43 mRNA、β-Actin mRNA的相对表达量。本实验数据依据ABi官方的分析方法Log2R[R=(1+E1)︿△Ct1(Control-Sample)/(1+E2)︿△Ct2(Control-Sample)]为最终相对值进行统计学分析。

1.4统计学分析应用SPSS22.0统计软件包进行统计学分析，根据所整理的实验结果数据情况对计量资料进行检验及相关性分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1结节性甲状腺肿及甲状腺癌中MT-P43mRNA转录水平的相对表达量31例结节性甲状腺肿患者的病灶组织与病灶旁组织的MT-P43mRNA相对表达量(图1)分别为(1.62±0.30)、(0.73±0.19)，差异具有统计学意义(t=-13.803，P=0.000)； 31例甲状腺癌组织与癌旁组织的荧光定量PCR(RT-qPCR)相对表达量分别(1.81±0.09)、(0.82±0.10)，差异有统计学意义(t=-33.234，P=0.000)。其凝胶电泳图和扩增、溶解曲线图见图2、图3。

2.2结节性甲状腺肿及甲状腺癌中MT-P43mRNA表达的倍比关系31例结节性甲状腺肿病灶组织与病灶旁组织RT-qPCR得出的MT-P43倍比关系为(3.26±0.43)(t=4.35,P=0.000)；31例甲状腺癌与癌旁组织RT-qPCR得出的MT-P43倍比关系为(4.04±0.19)(t=3.375,P=0.001);甲状腺癌组织与结节性甲状腺肿组织RT-qPCR得出的MT-P43倍比关系为(5.52±0.30)(t=2.040,P=0.025)(表1)。

nMT-P43倍比关系t值P值甲状腺肿组织/甲状腺肿旁组织313.26±0.434.3500.000甲状腺癌组织/癌旁组织314.04±0.193.3750.001甲状腺癌组织/甲状腺肿组织315.52±0.302.0400.025

a： MT-P43 mRNA RT-PCR扩增曲线

b： MT-P43 mRNA RT-PCR溶解曲线

c： Bactin mRNA RT-PCR扩增曲线

d： Bactin mRNA RT-PCR溶解曲线

e： MT-P43 mRNA RT-PCR标准曲线

f： Bactin mRNA RT-PCR标准曲线

图3MT-P43 mRNA 荧光定量图

31例甲状腺癌MT-P43mRNA转录水平与患者性别(F=1.556, P=0.226)、年龄(F=0.102, P=0.752)、肿瘤大小(F=0.075, P=0.785)无关，与有无淋巴结转移(F=31.617, P=0.000)和病理分期(F=34.788, P=0.000)有关(表2)。

表2　MT-P43mRNA转录水平与临床病理间的关系(±s)

3　讨论

近年来甲状腺疾病的发病率呈持续上升趋势，尤其是结节性甲状腺肿和甲状腺癌分别成为甲状腺良恶性疾病的两大主要病种[10]。Framinghan数据库对结节性甲状腺肿(NG)发病率的统计结果为5.0%～10.0%，女性患者是男性的4倍以上[11]，而甲状腺癌(TC)的发病率为11.9/10万，其中男性为4.7/10万，女性为13.8/10万[12]。甲状腺的主要功能是合成、储存和分泌甲状腺激素，甲状腺激素参与调节基础代谢水平、细胞分化和生长、心脏功能等多种生理过程，这些过程多是通过对线粒体的数量和蛋白质表达种类的调节实现的。

甲状腺素(T3)生理功能的分子机制是核受体途径，主要的核受体是TRα和TRβ基因编码合成2种类型4种异构的甲状腺激素受体：分别为TRα1、TRα2、TRβ1、TRβ2，其中TRα1起主要作用[13]。T3的主要受体之一MT-P43是TRα1的一个分子量为43 ku的表达产物，其能够通过改变与T3的结合状态影响线粒体的功能，进而改变甲状腺激素的各种调节过程。MT-P43存在于线粒体基质中，线粒体过氧化物酶增殖体激活受体和线粒体维甲酸X受体作为辅助蛋白可分别与MT-P43形成异二聚体，与线粒体三碘甲状腺原氨酸(T3)反应元件(mitochondrial thyroid hormone receptor responsive element, mt-TRE)结合，参与甲状腺激素对线粒体的基因转录和线粒体生成等多种调节。凝胶转移实验证实MT-P43能与线粒体DNA中4个线粒体T3反应元件(mt-TRE)有效结合, 分别是线粒体D环的DR2序列、位于编码12S rRNA基因处的DR0序列、位于编码16S rRNA基因的反向回文IP7序列和RSV-TRE样序列[14]。MT-P43是一个强有力的T3依赖性线粒体基因转录因子，其在T3存在的情况下可迅速激活线粒体RNA多聚酶，进而激活线粒体基因的早期转录，使线粒体RNAs水平增加，线粒体相应蛋白合成增加，从而促进线粒体生成。另外，MT-P43可激活细胞色素-C-氧化酶活性，增加线粒体膜电位，使呼吸链功能加强，参与调节呼吸链功能；MT-P43还可通过增加线粒体相应蛋白的合成增强呼吸链功能。

近年来对MT-P43的相关研究显示，MT-P43低表达或不表达可表现在小鼠低血糖时不能刺激胰岛素分泌并增加胰岛素抵抗[15]；实验小鼠睾丸线粒体与核之间的cdk4和c-myc通路上调，使T3表现为限制产后生殖细胞的增殖[16]。P43过表达会影响肌纤维的数量、新陈代谢、线粒体的有氧呼吸及肌纤维的收缩特性，从而增加氧耗，导致MyHCIIa纤维部分被I型纤维所取代[17-18]。本实验通过对T3相关受体MT-P43在甲状腺良、恶性肿瘤中是否存在表达差异了解其是否参与了相关肿瘤的特殊代谢作用。结果显示，结节性甲状腺病变组织较病变旁组织MT-P43 mRNA的相对表达量高，甲状腺癌组较癌旁组织的相对表达量高，结节性甲状腺肿组较甲状腺癌组织低表达，说明MT-P43表达量高对应的组织代谢相对活跃，越容易发生病变；MT-P43在结节性甲状腺肿组织与病变旁组织、甲状腺癌组织与癌旁组织的倍比关系趋势也再次说明MT-P43增高可以成为提示甲状腺恶性疾病的一个有效指标。

目前已知有3条细胞凋亡信号通路：线粒体通路、死亡受体通路和内质网通路，其中线粒体通路是凋亡的最主要途径。线粒体是细胞产生能量的重要细胞器，有关实验证实线粒体在T3介导的甲状腺激素受体作用下有抑制细胞凋亡的作用[19]。本研究初步证实了线粒体内的T3受体之一MT-P43具有促进甲状腺疾像恶性转化的趋势。对该因子作用机制的进一步研究将会对甲状腺疾病的早期诊断、甲状腺癌治疗方式的选择、术后甲状腺癌复发风险的评估等方面提供帮助，具有较高的研究价值。

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(本文编辑杨晨晨)

Mitochondrial P43 hormone receptor expression in thyroid papillary carcinoma and clinical value

SHAO Guoan1, LI Shiliang1, XU Lei1, MA Binling1, ZHU Lanhua1

(1DepartmentofThyroidandBreastSurgery,TheFifthAffiliatedHospital,1DepartmentofThyroidandBreastSurgery,AffiliatedTumorHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo investigate the transcription level of mitochondrial hormone receptor (in fragments of MT-P43) in thyroid carcinoma tissue and nodular goiter tissue , and the relationship between the transcription level of P43 and clinical pathology of thyroid cancer. MethodsMT-P43 mRNA transcription and expression in 31 cases of thyroid carcinoma and 31 cases of nodular goiter fresh specimens were detected by real-time fluorescent quantitative PCR(RT-PCR). ResultsThe transcription of MT-P43mRNA in the group of nodular goiter and thyroid cancer were higher than their counterparts of the adjacent normal tissue. MT-P43mRNA transcription level raised obviously in 31 cases of nodular goiter, and it was (3.26±0.43) times the quantity of that in the adjacent normal tissue, and the difference was statistically significant (t=4.35, P=4.35). The transcription level of MT-P43mRNA raised obviously in 31 cases of thyroid carcinoma compared to that of the para-tumorous. The relative ratio of transcription level of MT-P43mRNA was (4.04±0.19) between thyroid carcinoma tissue and their para-tumorous tissue, and the difference was statistically significant (t=3.375, P=3.375). MT-P43mRNA transcription level in thyroid carcinoma group rose more than that in the nodular goiter group. The relative ratio was (5.52±0.30) between those two groups, and the the difference was statistically significant (t=2.040, P=2.040). MT-P43mRNA transcription level was not related to the patients′ gender, age and tumor size (P>0.05); While it was associated with lymph node metastasis and clinical pathologic staging (P<0.05). Conclu-sionThe raising of MT-P43mRNA transcription levels may promoting malignancy of thyroid. The higher the level of transcription, the easier the thyroid tissue transform to malignantion, which is valuable for the diagnosis and differential diagnosis of thyroid carcinoma.

thyroid carcinoma; Nodular goiter; mt-P43; RT-PCR

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2012221A050)

邵国安(1968-)，男，硕士，主任医师，副教授，研究方向：肿瘤基础与临床，E-mail：gzbdz@tom.com。

R737.9

A

1009-5551(2016)06-0707-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.010

2016-01-11]