Thrsp蛋白在乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株中表达及鉴定

王　霞, 吕　蒙, 徐　虓, 刘志英, 高晓丽

(新疆医科大学1第五附属医院药剂科, 2附属肿瘤医院核医学科, 3第五附属医院教学科研办公室,4第五附属医院病理科, 5第五附属医院超声科, 乌鲁木齐　830011)



·民族肿瘤学·

Thrsp蛋白在乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株中表达及鉴定

王霞1, 吕蒙2, 徐虓3, 刘志英4, 高晓丽5

(新疆医科大学1第五附属医院药剂科,2附属肿瘤医院核医学科,3第五附属医院教学科研办公室,4第五附属医院病理科,5第五附属医院超声科, 乌鲁木齐830011)

目的鉴定Thrsp甲状腺激素应答蛋白( Thrsp, S14 )在乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞株中的表达，并建立2株细胞的标准生长曲线，为研究甲状腺激素应答蛋白在乳腺癌细胞转移增殖中的作用及机制奠定基础。方法取对数生长期的乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞，用CCK8法检测，用Excel自带统计软件求平均值并绘制生长曲线。细胞爬片，Thrsp蛋白免疫组化SP法染色，DBA显色，显微镜下观察，采用Western Blot法检测2株细胞中Thrsp蛋白表达及相对量。结果连续培养72 h MCF-7、MDA-MB-231细胞株达到对数生长期。Thrsp蛋白在乳腺癌细胞株MDA-MB-231中呈弱阳性表达，在MCF-7中呈阳性表达。Thrsp蛋白电泳大小位于17 ku。MBA-MD-231细胞株中Thrsp蛋白表达水平低于MCF-7细胞株,与免疫组化结果一致。 结论Luminal A乳腺癌细胞株MCF-7细胞株中Thrsp蛋白表达正常；Basal细胞株MDA-MB-231中Thrsp蛋白表达下调。

乳腺癌； MCF-7； MDA-MB-231； Thrsp蛋白

全球癌症报告最新版中指出乳腺癌占女性恶性肿瘤的29%[1]，已经成为影响女性健康的第一杀手[2]。新疆乳腺癌的发病率也呈现逐年上升趋势。临床上观察发现维吾尔族乳腺癌具有从发现包块至就诊的间隔时间长、肿瘤较大、临床分期较晚、3年生存率和5年生存率低的特点[3-4]。甲状腺激素可通过甲状腺激素应答蛋白(Thyroid hormone-responsive spot 14 protein，S14 )作用于乳腺癌细胞，但具体的机制尚不清楚[5]。THRSP在乳腺癌组织中往往呈现高表达，关于甲状腺激素在乳腺癌晚期患者中的治疗价值也存在不一致的报道。Zhu等[6]发现Thrsp是乳汁中脂质合成所必需的，影响着乳腺上皮细胞的增殖。THRSP在乳腺癌细胞株T47D(人脂肪合成细胞株)中过表达可加速肿瘤细胞生长，其表达缺失会使细胞生长停滞并诱导凋亡[7]。侵袭性乳腺癌病人低水平表达的Thrsp蛋白与无病长期生存状态有关，而Thrsp蛋白高表达标识乳腺癌的高风险，提示预后不良[8]。Sanchez-Rodriguez等[9]发现，Thrsp蛋白过表达，抑制了癌细胞的增殖和非锚定依赖性生长，诱导了乳腺癌细胞分化和死亡，使乳腺癌活细胞数量明显减少。其结果与其他细胞培养系统或THRSP敲除所观察的凋亡现象不符合。在人类乳腺癌组织中观察结果也强烈表明了相反的结论，该研究组运用的组织培养体系可能没有真实地模拟人类乳腺癌。临床工作中发现，乳腺癌晚期患者大多有甲状腺功能低下。甲状腺激素不是乳腺癌发生、发展的主导机制，但因其参与了乳腺细胞恶变及转移过程中细胞能量和新陈代谢的重要方面越来越引起临床医生的注意。

本研究以乳腺癌细胞系中典型的LuminalA乳腺癌细胞株MCF-7和Basal细胞株MDA-MB-231[10]为研究对象，体外培养并鉴定2株细胞中甲状腺激素应答蛋白(Thrsp)的表达，为进一步研究甲状腺激素及甲状腺激素应答蛋白在乳腺癌细胞转移增殖中的作用及机制奠定基础。

1　材料与方法

1.1实验材料人MCF-7、人MDA-MB-231细胞株均购自南京凯基生物有限公司。

1.2主要仪器CO2细胞培养箱 (上海力康仪器有限公司Smart Cell HF-90)，荧光倒置显微镜(日本尼康公司 Eclipse)，全光栅酶标仪(美国BIO-RAD公司X-marktm)，电子分析天平(德国梅特勒 AB304-S)，化学发光成像仪系统(上海勤翔科学仪器有限公司Chemiscope 3000)，蛋白转膜仪(Mini-PROTEAN Tetra system ，Bio-Rad， USA)。

1.3主要试剂胎牛血清(美国Life technologies公司)，DMEM(高糖)(美国Life technologies公司)，0.25%胰酶(美国Life technologies公司)，青霉素-链霉素双抗(10000U)(美国Hyclone公司)，CCK8试剂(上海贝博生物试剂公司)，Anti-THRSP antibody(Abcam)，β-actin(Abcam)，BCA Protein Assay Kit(Beijing Tiangen)， PVDF Transfer Membrane (0.45 μm) (Millipore)。

1.4MDA-MB-231、MCF-7细胞生长曲线的绘制取生长良好的MDA-MB-231、MCF-7细胞，用DMEM完全培养基制备成 5×104/mL单细胞悬液，接种至96孔板中(100 μL/孔，即每孔5×103个细胞/孔)，分别培养6 h及1、2、3、4、5、6 d，每组5个重复，用CCK8试剂检查OD450值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标拟合细胞生长曲线。

1.5MDA-MB-231、MCF-7细胞株Thrsp蛋白表达免疫组化及Western Blot鉴定取对数生长期细胞胰酶消化后计数重悬于完全培养基中，在6孔板中滴入少许培养基后放入盖玻片，每孔加入2 mL 5×105/mL细胞悬液。37℃、5% CO2培养24 h 贴壁，换液后继续培养24 h。取出盖玻片，PBS洗2遍后用4%的多聚甲醛室温固定15 min。漂洗晾干后1% TritonX-100 37℃通透30 min，PBS清洗2遍。加入3%过氧化氢15 min，PBS清洗2遍。滴加一抗Thrsp (1∶200)， 4℃过夜，加通用型生物素化二抗，室温孵育15 min。DAB显色，苏木素染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明后中性树胶封片。常规裂解乳腺癌细胞，按照Western Blot标准实验步骤点样、转膜。β-actin抗体浓度为1∶5 000，Thrsp蛋白抗体浓度为1∶500；二抗孵育后显色，显色后用ChemiScope mini化学发光仪检测、拍照，计算目的蛋白的积分光密度值，并与β-actin比较，计算目的蛋白的表达丰度。

1.6Thrsp阳性表达判断标准高倍镜下观察，细胞内出现粗大棕黄色颗粒定为阳性表达，细胞内出现少量细小棕黄色颗粒定为弱阳性表达，细胞内无棕黄色颗粒定为阴性表达。

2　结果

2.1MDA-MB-231、MCF-7细胞株标准生长曲线由细胞培养曲线可以看出连续培养72 h， 2株细胞均达到对数生长期，生长良好(图1)，可用于进一步实验。

2.2MDA-MB-231、MCF-7细胞株的Thrsp蛋白免疫组化鉴定结果在MDA-MB-231中PBS代替一抗Thrsp蛋白不显色，细胞胞浆内未见棕黄色颗粒(图a、b)； Thrsp蛋白在乳腺癌细胞株MDA-MB-231中呈弱阳性表达，胞浆内可见细小棕黄色颗粒(图c、d )。在MCF-7中PBS代替一抗Thrsp蛋白不显色，细胞胞浆内未见棕黄色颗粒(图e、f)； Thrsp蛋白在乳腺癌细胞株MCF-7中呈阳性表达，胞浆内可见粗大棕黄色颗粒(图g、h)。

a： MDA-MB-231细胞阴性对照(×100)

b： MDA-MB-231细胞阴性对照( ×400)

c： MDA-MB-231细胞弱阳性表达Thrsp(×100)

d： MDA-MB-231细胞弱阳性表达Thrsp(×400)

e： MCF-7细胞阴性对照(×100)

f： MCF-7细胞阴性对照(×400)

g： MCF-7细胞阳性表达Thrsp(×100)

h： MCF-7细胞阳性表达Thrsp(×400 )

图2MDA-MB-231、MCF-7细胞株的Thrsp蛋白免疫组化鉴定结果

2.3MDA-MB-231、MCF-7细胞株THRSP蛋白Western Blot电泳检测结果Thrsp蛋白电泳大小位于17 ku，在MCF-7细胞株条带明显，在MDA-MB-231条带欠明显，见图3。

1： MCF7细胞株Thrsp蛋白的表达; 2： MBA-MD-231细胞株Thrsp蛋白的表达

图3不同样本Thrsp蛋白的表达(β-actin作为内参照)

2.4MDA-MB-231、MCF-7细胞株Thrsp蛋白半定量灰度值分析结果MCF-7 Thrsp/β-actin蛋白半定量灰度值分析结果为(0.460 3±0.0 162)； MBA-MD-231 Thrsp/β-actin蛋白半定量灰度值分析结果为(0.134 0±0.0 149)，低于MCF-7细胞株的表达，与免疫组化结果一致，见表1，图4。

细胞株Thrspβ-actionThrsp/β-actionMCF-792318±32482005480.4603±0.0162MBA-AD-23128368±31602116140.1340±0.0149t值31.55133.113P值<0.001<0.001

3　讨论

国内外许多研究表明，THRSP基因是调控苹果酸酶及脂肪酸合成酶等脂肪生成酶活性的转录因子，与脂肪肝、肥胖、糖尿病、脂肪代谢相关肿瘤(尤其是乳腺癌)等关系密切，然而其确切分子机制尚不明确[5]。近年来，THRSP基因与脂肪代谢的密切相关性而逐渐被重视，研究者们期待进一步明确其作用机制，从而为乳腺癌等脂质代谢性疾病的治疗提供新的方向。本研究针对乳腺癌细胞系中典型的LuminalA型乳腺癌细胞株MCF-7和Basal(三阴)型细胞株MDA-MB-231[10]为研究对象，通过培养细胞爬片免疫组化，Western Blot电泳检测及半定量灰度分析，实验结果表明，在乳腺癌细胞株MCF-7中Thrsp呈阳性表达，在细胞株MDA-MB-231中Thrsp呈弱阳性表达，Thrsp蛋白在MCF-7细胞株中相对表达量高于MDA-MB-231细胞株。由以上实验结果推论，ER、PR、Her-2受体完整型乳腺癌细胞株(LuminalA型乳腺癌细胞株)MCF-7中Thrsp蛋白表达正常；ER、PR、Her-2受体缺失型乳腺癌细胞株(Basal型细胞株)MDA-MB-231中Thrsp蛋白表达下调。

Her-2/neu基因转染的乳腺细胞cDNA微阵列显示FAS为Her-2/neu信号的主要目标[13]。增加HER2/neu阳性细胞中FAS的mRNA的表达，THRSP基因表达亦增加[14]。然而，Hilvo等[15]使用超高效液相色谱/质谱法获取了267例乳腺癌组织的综合脂类组学并联合免疫组化方法，发现FAS与HER2状态间并没有重要联系。本研究显示，ER、PR、Her-2受体完整型乳腺癌细胞MCF-7 Thrsp蛋白阳性表达，而ER、PR、Her-2受体缺失型细胞株MDA-MB-231 Thrsp蛋白表达较低，Thrsp蛋白与ER、PR、Her-2受体之间的联系尚待进一步研究的证实。孕激素和活性SREBP- 1c在乳腺癌细胞中协同诱导S14和FAS[16]。随后，Weels等[17]分析了131例乳腺癌组织中Thrsp和FAS表达，发现Thrsp高表达不受性类固醇激素受体、HER2/neu或cyclin D1指定。

本课题组之前研究利用免疫组化方法研究了112例乳腺癌组织中Thrsp蛋白的表达情况，发现人乳腺癌组织中Thrsp蛋白的表达与传统肿瘤标志物(ER、PR、Her-2)及基因分型间无显著相关性[18]。对于分子生物学水平的研究与部分临床病理参数之间的不一致性还有待进一步研究。

Thrsp在脂肪合成的人乳腺癌细胞株(T47D)中过表达加速肿瘤细胞生长，其表达缺失会使细胞生长停滞并诱导凋亡[7]。低水平的Thrsp与侵袭性乳腺癌病人无病长期生存状态有关，而Thrsp高表达标识乳腺癌的高风险，提示预后不良[8]。然而，Sanchez-Rodriguez等[9]观察到Thrsp过表达抑制了癌细胞的增殖和非锚定依赖性生长，诱导了癌细胞分化和死亡，活癌细胞数量明显减少，这一结果不符合于其他细胞培养系统或Thrsp敲除所观察的凋亡现象；在实际的人类乳腺癌观察结果也强烈表明了相反的结论。Sanchez-Rodriguez等[9]研究组运用的组织培养体系可能没有真实地模拟人类乳腺癌。对此，目前实验研究证实FAS抑制剂可通过减少肿瘤组织中脂肪形成抑制肿瘤生长[19-20]。相信THRSP基因在脂质合成表型乳腺癌的研究将会成为未来一大热点，尤其是针对于THRSP基因的抗肿瘤药物的研发会是人类克服乳腺癌的福音。

THRSP的编码基因位于染色体11q13上，此处的基因通常在乳腺癌中高表达，因此THRSP又被认为可能在这类肿瘤中起着控制代谢和生长的作用。目前对于Thrsp蛋白参与脂肪酸合成及参与乳腺癌的发生及发展得到较多分子生物研究层面的支持。但是Thrsp蛋白调控的具体生物化学机制尚不明确，如何参与调控脂肪合成、抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡的机制、Thrsp蛋白是否可以作为乳腺癌潜在的治疗靶点等等问题需要进一步研究去解决。

[1]Rebecca LS, Kimberly DM. Cancer Statistics 2015[J]. Ca Cancer J Clin，2015, 65(1):25-29.

[2]Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. Ca Cancer J Clin, 2011, 61(2):69- 90.

[3]成芳，木克代斯，司马义，等. 新疆维吾尔族女性乳腺癌危险因素的病例对照研究 [J].中国卫生统计，2010，27 (4):364-368.

[4]成芳，张茜，刘卫华，等. 2019例汉族、维吾尔族乳腺癌临床病理资料分析 [J]. 肿瘤防治研究，2010，36(11):1312-1314.

[5]Kuemmerle NB, Kinlaw WB.THRSP (thyroid hormone responsive) [J]. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol, 2011, 15(6):480-482.

[6]Zhu Q, Anderson GW, Mucha GT, et al. The Spot 14 protein is required for de novo lipid synthesis in the lactating mammary gland[J]. Endocrinology,2005,146(8):3343-3350．

[7]Martel P, Bingham C, McGraw C, et al. S14 protein in breast cancer cells:direct evidence for regulation by SREBP-1c, superinduction with progestin, and implication in cell growth[J]. Exp Cell Res, 2006,312(3):278-288.

[8]Menendez JA, Lupu R． Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis[J]. Nat Rev Cancer,2007,7(10):763-777．

[9]Sanchez-Rodriguez J, Kanininda-Tshilumbu J, Santos A, et al.The spot 14 protein inhibits growth and induces differentiation and cell death of human MCF-7 breast cancer cells[J]. Biochem J, 2005, 390(Pt1):57-65.

[10]Subik K, Lee JF, Baxter L,et al. The expression patterns of ER, PR, HER2, CK5/6, EGFR, Ki-67 and AR by immunohistochemical analysis in breast cancer cell lines[J]. Breast Cancer (Auckl), 2010, 4(1):35-41.

[11]Colbert CL, Kim CW, Moon YA, et al.Crystal structure of Spot 14，a modulator of fatty acid synthesis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(44):18820-18825.

[12]Zhang W, Peng W, Zhao M, et al. Expression,purification and preliminary crystallographic analysis of human thyroid hormone responsive protein[J]. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2011, 67(Pt 8):941-946．

[13]Kumar-Sinha C, Ignatoski K, Lippman M, et al. Transcriptome analysis of Her2 reveals a molecular connection to fatty acid synthesis[J]. Cancer Res, 2003, 63(1):132-139.

[14]Kinlaw WB, Quinn JL, Wells WA, et al. Spot 14:A marker of aggressive breast cancer and a potential therapeutic target[J]. Endocrinology, 2006, 147(9):4048-4055.

[15]Hilvo M, Denkert C, Lehtinen L, et al. Novel theranostic opportunities offered by characterization of altered membrane lipid metabolism in breast cancer progression[J]. Cancer Res, 2011, 71(9):3236-3245.

[16]Alli P, Pinn M, Jaffee E, et al. Fatty acid synthesis inhibitors are chemopreventive for mammary cancer in neu-N transgenic mice[J]. Oncogene, 2005, 24(1):39-46.

[17]Wells W, Schwartz G , Morganelli P, et al. Expression of “Spot 14” (THRSP) predicts disease free survival in invasive breast cancer:immunohistochemical analysis of a new molecular marker[J]. Breast Cancer Res Treat,2006, 98(2):231-240.

[18]徐 虓，王 霞，刘志英，等. THRSP蛋白在人类乳腺癌组织中的表达及临床意义[J]. 新疆医科大学学报，2016，39(1)：37-41.

[19]Donnetly C, Olsen AM, Lewis LD, et a1.Conjugated linoleic acid (CLA) inhibits expression of the Spot14 (THRSP) and fatty acid synthase genes and impairs the growth of human breast cancer and liposarcoma cells[J]. Nutr Cancer, 2009, 61(1):114-122.

[20]Agostini M, Almeida LY, Bastos DC, et al. The Fatty Acid synthase inhibitor orlistat reduces the growth and metastasis of orthotopic tongue oral squamous cell carcinomas[J]. Mol Cancer Ther,2014, 13(3):585-595.

(本文编辑杨晨晨)

Expression and identification of Thrsp protein in breast cancer MCF-7 and MDA-MB-231 cell lines

WANG Xia1, LV Meng2, XU Xiao3, LIU Zhiying4, GAO Xiaoli5

(1DepartmentofPharmacy，theFifthAffiliatedHospital；2DepartmentofNuclearMedicine,AffiliatedTumourHospital;3DepartmentofTeachingandResearch,TheFifthAffiliatedHospital;4DepartmentofPathology,TheFifthAffiliatedHospital,5DepartmentofUltrasonography,TheFifthAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo identify the expression of thyroid hormone responsive prote (Thrsp) in MCF-7 and MDA-MB-231 cell Lines of breast cancer. The standard growth curve of the 2 cell line was established. In order to lay the foundation for the founction and mechanism of transfer and proliferation of the breast cancer cell lines by Thrsp protein. MethodsTo select breast cancer MCF-7, MDA-MB-231 cells in the logarithmic growth phase, detected by CCK8 method, using Excel to calculate the mean value and built the growth curve, the cell climbing piece, Thrsp protein was stained by immunohistochemistry SP method, DBA coloration, observed by microscope, the Western Blot method was used to detect the expression and the relative amount of Thrsp protein in 2 cells. ResultsContinuous culturing for 72 hours, MCF-7 and MDA-MB-231 cell line were reaching the logarithmic growth phase. Thrsp protein were expressed weakly positive in MBA-MD-231,and positive in MCF-7. The electrophoresis size of Thrsp protein were 17 ku. The expression of Thrsp protein in MBA-MD-231 were a bit lower than that in MCF-7 which were tested by Western-blot. And the results were consistent with immunohistochemical results. ConclusionThrsp protein was expressed normally in Luminal A breast cancer MCF-7cell line. Thrsp protein was expressed a bit lower in Basal-like cell line MDA-MB-231.

breast cancer; MCF-7; MDA-MB-231; Thrsp protein identification

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2014211C128)

王霞(1976-)，女，硕士，副主任药师，副教授,研究方向：乳腺癌、甲状腺癌分子致病机制及药学应对策略。

徐虓，男，博士，副主任医师，副教授, 研究方向：乳腺癌、甲状腺癌分子致病机制及应对策略，E-mail：329590035@qq.com。

R73-35; R73-37

A

1009-5551(2016)06-0692-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.06.007

2016-03-21]