磷脂酶A2改性蛋黄磷脂的研究

庞　坤

(信阳农林学院 牧医工程学院，河南 信阳 464000)



磷脂酶A2改性蛋黄磷脂的研究

庞坤

(信阳农林学院 牧医工程学院，河南 信阳 464000)

天然磷脂的亲水性差，采用磷脂酶对其进行酶法改性可提高乳化性和稳定性，扩大应用范围。本研究利用自制的磷脂酶A2发酵蛋黄磷脂，通过反应时间、酶浓度、底物浓度、钙离子浓度、起始pH值、温度等单因素实验和多因素正交实验，确定最适的反应条件，为实际生产利用提供参考。结果表明， 20g蛋黄底物，反应时间4h，磷脂酶A2水解蛋黄磷脂条件的最佳配比为：起始温度40℃、pH值8.0、酶浓度0.15IU/mL、钙浓度30mmol/L，此条件下生成的溶血磷脂转化率为80%左右。

蛋黄磷脂；磷脂酶A2；酶改性

磷脂为含有磷酸的类脂化合物，是生物细胞膜的主要构成成分，具有维持生物膜的活性、参与神经细胞间的信息传递、调节机体的新陈代谢等功能[1]。它以乳化剂、抗氧化剂、营养保健品等广泛应用于食品、化妆品、医药等行业。但是天然磷脂的亲水性较差，现在常采用酶法改性的方法，即利用磷脂酶水解磷脂，使之转化成溶血磷脂，从而提高其稳定性和乳化性。因此，自20世纪90年代磷脂的改性成为国内外学者关注的热点。但是这些研究大多集中在大豆磷脂上，对蛋黄磷脂的改性研究很少。

本实验以蛋黄为对象，利用重组变铅青链霉菌菌株发酵生产出的PLA2进行水解反应，通过底物、酶、CaCl2、pH、温度、时间等单因素实验和多因素正交实验研究蛋黄磷脂改性的最佳反应条件，为生产实践提供数据参考。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器

试剂：卵磷脂(上海伯奥生物科技有限公司)；磷脂酶A2(实验室自制，源自含高拷贝PLA2基因质粒的重组变铅青链霉菌)；NaOH、CaCl2等，市售分析纯。

仪器：奥豪斯电子精密天平，85-2型上海司乐恒温磁力搅拌器，北京长风电热恒温水浴锅，上海百典大振幅恒温冷冻摇床，日立 CR-21G 高速冷冻离心机。

1.2实验方法

1.2.1磷脂酶A2发酵液的制备重组变铅青链霉菌孢子按照0.05%接种于2%黄豆饼粉培养基，28℃摇床，180r/min，培养48h形成种子液。在同样的条件下，种子液按照5%的接种量再连续转接3次，制备的培养液8000 r/min离心，上清液即含有磷脂酶A2的发酵液。

1.2.2发酵液磷脂酶A2活力的测定3mL发酵液和27mL 0.35%卵磷脂悬液在冰浴中混合均匀，平均分装到6支试管中。3支试管(反应管)放在50℃水浴中，另外3支试管(对照管)放在冰浴中。15min后将3支反应管迅速放入冰浴中。分别向对照管和反应管中加50μl 1%酚酞指示剂，再用已标定的4mmol/L NaOH溶液去滴定反应管，直至反应管与对照管的颜色相同，根据滴定所消耗NaOH的体积V(mL)计算发酵液的酶活力。酶活力(IU)为每分钟水解1微摩尔卵磷脂所需的酶量。

酶活力(IU)=4×V/(15×3/6)

1.2.3蛋黄的酶解实验为了使磷脂水解为溶血磷脂，实验利用磷脂酶A2发酵液处理蛋黄。试验分为六组单因素实验和1组正交实验。反应一定的时间后，用已标定的4mmol/L NaOH滴定反应中生成的游离脂肪酸量，进而计算溶血磷脂(LPC)的转化率。

1.2.3.1时间对酶解反应的影响在250mL的三角瓶中，配制20g蛋黄、30mmol/L CaCl2、0.10IU/mL酶浓度，pH值=6.0，总体积为100mL的反应体系，180r/min，40℃振荡培养6h。每隔1h取200μL反应液稀释至5mL，放在冰浴中，加1%酚酞指示剂50μl，4mmol/L NaOH滴定至微红色。NaOH消耗的体积V(mL)(V =各时间段滴定消耗的NaOH体积-0h滴定消耗的NaOH的体积)。

1.2.3.2酶浓度对酶解反应的影响配制100mL反应体系，其中底物20g蛋黄，CaCl2浓度30mmol/L，pH=6.0，酶浓度设5个梯度，分别为0.05IU/mL、0.10IU/mL、0.15IU/mL、0.20IU/mL、0.25IU/mL。40℃条件下，180r/min振荡培养4h。在0h和4h时间段分别取200μL反应液稀释后滴定(试验操作同1.2.3.1)。NaOH消耗的体积V(mL)(V =4h滴定消耗的NaOH体积-0h滴定消耗的NaOH的体积)。

1.2.3.3底物浓度对酶解反应的影响底物蛋黄分别以10g、15g、20g、25g、30g，30mmol/LCaCl2，0.10 IU/mL酶浓度，pH值=6.0的100mL反应体系。反应条件、操作方法和计算同1.2.3.2。

1.2.3.4钙离子浓度对酶解反应的影响100mL反应体系中底物蛋黄20g，酶浓度0.10IU/mL，pH=6.0 ，CaCl2浓度分别加入0、10、20、30、40、50mmol/L，反应条件、操作方法和计算同1.2.3.2。

1.2.3.5起始pH值对酶解反应的影响20g蛋黄，30mmol/L CaCl2，0.10IU/mL酶浓度的100mL反应体系，调节起始pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。反应条件、操作方法和计算同1.2.3.2。

1.2.3.6温度对酶解反应的影响100mL反应体系中，20g蛋黄，酶浓度0.10IU/mL，CaCl2浓度30mmol/L，pH值=6.0，设定温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃，反应条件、操作方法和计算同1.2.3.2。

1.2.3.74因素3水平正交实验根据单因素实验的结果，在底物蛋黄20g的100mL反应体系中，选择酶浓度、钙离子浓度、起始pH、温度为影响因素，180r/min振荡培养4h，进行4因素3水平正交实验，从而确定含有磷脂酶A2的发酵液水解蛋黄磷脂的最优反应条件。

表1　L9(34)正交试验因素水平表

1.2.3.8 数据计算游离脂肪酸(FFA)的生成量(μmol)=NaOH的摩尔浓度×(4h时NaOH滴定体积—0h时NaOH滴定体积)×100×25/(蛋黄的质量×5)

LPC转化率(%)=蛋黄水解后生成的FFA量×100%/(蛋黄完全水解后生成的FFA量×蛋黄中PC的含量)

为了计算LPC转化率，实验中采用蛋黄含10%的PC，1g PC完全水解释放1200μmol FFA 。即 LPC转化率(%)= 蛋黄水解后生成的FFA量×100%/(1200×10%)。

2　结果与分析

2.1底物浓度对酶解反应的影响

图1底物浓度对LPC转化率的影响图2酶浓度对LPC转化率的影响

由图1可以看出，随着底物浓度的增加，NaOH消耗量逐渐增加，LPC的转化率逐渐降低。磷脂酶A2水解磷脂的反应为一界面反应，当底物浓度较低时，易在反应体系均匀分散，反应界面较大，反应程度高。但是随着底物浓度的增加，底物之间相互包埋，不易分散，因此造成反应难度增大，反应程度降低[2]。

2.2酶浓度对酶解反应的影响

实验中反应速度随着磷脂酶A2浓度的增加而增加，LPC的转化率也逐渐升高。但酶浓度达到0.10IU/mL时，反应基本平衡，LPC转化率已接近最大值。由于反应界面面积一定，部分酶分子饱和反应的油水界面，阻止其它的酶分子达到反应界面，导致反应出现饱和现象[3]，Fujita S在研究动物磷脂酶的试验中也发现类似的情况[4]。

2.3CaCl2浓度对酶解反应的影响Ca2+浓度与LPC转化率关系的曲线呈抛物线形式，当Ca2+浓度为30mmol/L时，LPC的转化率最大。Ca2+结合在磷脂酶A2的活性中心上，是酶必需的辅助因子，不能由其它离子代替[5]。一些学者认为Ca2+对维持酶高级结构具有非常重要的作用，在反应过程中，它还可以帮助磷脂酶A2从产物中分离出来，再重新催化化学反应[6]。Ca2+浓度的大小对磷脂酶A2催化的反应有两种不同的影响。低浓度时，Ca2+浓度增加反应速度加快；但Ca2+浓度过高，磷脂酶A2因盐析作用活性下降，从而反应速度降低。此外，大量的Ca2+也影响产品的品质[7]。

图3CaCl2浓度对LPC转化率的影响图4起始pH对酶解反应的影响

2.4起始pH对酶解反应的影响

pH=7.0时，磷脂酶A2活性最好，LPC的转化率最大。pH的作用机制很复杂，对酶和底物都有影响，pH过高或过低都将降低反应速度[8]。试验中发现室自制的磷脂酶A2有较宽的适用范围，在pH5.0～9.0区间都有很强的酶活性，与Yoshinori M的研究结果类似[9]。

2.5反应温度对酶解反应的影响

温度升高LPC转化率也随之升高，当温度大于50℃时，LPC转化率开始降低。这是因为温度升高，反应体系的粘度降低，扩散系数增大，促进反应体系的分散，有利于反应的进行[10]。但是反应温度过高，磷脂酶A2变性失活，导致反应速度降低。另外，高温容易使磷脂氧化变质，影响其品质。

图5反应温度对酶解反应的影响图6反应时间对酶解反应的影响

2.6反应时间对LPC转化率的影响

磷脂酶A2水解蛋黄磷脂的反应速度较快，在4h内反应基本结束。实验室制备的磷脂酶A2在较短的时间内可以迅速完成反应，防止了蛋黄的腐败变质，适用于工业生产。

2.7正交试验结果

使用软件SPSS13.0进行实验正交分析设计和方差分析，数据结果显示酶浓度达到了显著水平(P<0.05)，对酶解反应的影响最大；其它影响因素(起始pH、温度、钙浓度)都没有达到显著水平。根据试验数据并结合实际生产，最终确定磷脂酶A2水解蛋黄磷脂的最佳配比为A3B3C2D2，即0.15IU/mL酶浓度、起始pH8.0，40℃温度，30mmol/L钙浓度。在这种优化的条件下进行酶解试验，LPC转化率在80%左右。

表2　正交试验的实验结果

3　讨论

目前，国内外学者主要关注大豆磷脂的研究，而鸡蛋磷脂因成本较高很少涉及。中国的鸡蛋产量居世界首位，资源丰富，具有巨大的特色开发潜力。我们可以利用磷脂酶A2对蛋黄进行处理，制备酶改性蛋黄磷脂，从而提高鸡蛋的经济价值。

实验中的磷脂酶A2来源于实验室自制的重组变铅青链霉菌。该菌株发酵条件简单，可以通过大规模的发酵生产大量的磷脂酶A2。因此，以蛋黄为底物进行磷脂酶A2水解反应，不仅发酵工艺简化，生产成本大大降低，而且磷脂也有较高的转化率，为实际生产利用创造了条件。后续的实验证明，与普通的磷脂相比较，酶改性蛋黄磷脂在乳化性、抗温性、抗pH性等方面均有明显的优势。

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(编辑：严佩峰)

The Study On Enzymic Modification of Egg Yolk Phospholipids With Phopholipase A2

PANG Kun

(College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Xinyang Agriculture and Forestry University，Xinyang 464000,China)

The hydrophilic property of natural phospholipids is poor, and it can be improved by using phospholipase to improve the emulsifying property and stability, and expand the application range. In this study, phospholipase A2 homemade fermented egg yolk phospholipids, by reaction time, enzyme concentration, substrate concentration, calcium ion concentration, initial pH, temperature and other single factor and multi-factor orthogonal experiment to determine the optimal reaction conditions and provide a reference for the actual production use. The results showed that, 20g egg yolk substrate, the reaction time 4h, the best ratio of phospholipase A2 yolk phospholipids conditions as follows: starting temperature 40 ℃, pH value 8.0, the enzyme concentration 0.15IU / mL, calcium concentration 30mmol / L, this lysophospholipid produced under the conditions of conversion was about 80%.

egg yolk phospholipids；phospholipase A2 ；an enzyme modified

2016-01-20

庞坤 (1977—)，女，河南永城市人，硕士，讲师，研究方向：动物生理生化.

TQ645.96

A

2095-8978(2016)02-0098-04