临床分离非伤寒沙门菌耐药性及对头孢曲松耐药机制

师 伟，夏琳林，刘晓霞，韩双羽，杨 杰，赵 展，王玉宝（天津医科大学第二医院感染性疾病研究所，天津 300211）

论著

临床分离非伤寒沙门菌耐药性及对头孢曲松耐药机制

师 伟，夏琳林，刘晓霞，韩双羽，杨 杰，赵 展，王玉宝
（天津医科大学第二医院感染性疾病研究所，天津 300211）

目的 了解临床分离非伤寒沙门菌（NTS）耐药情况及对头孢曲松的耐药机制，为防治NTS感染与合理使用抗菌药物提供依据。方法 选取2014年5—10月天津医科大学第二医院和天津医科大学总医院肠道门诊急性腹泻患者粪便标本分离的108株NTS，对其进行药敏试验；对头孢曲松不敏感的NTS进行血清学分型、多位点序列分型（MLST）、脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型以及超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和AmpC基因检测。结果 108株NTS对11种抗菌药物的单药耐药率为49.07%（53株），多重耐药率为17.59%。对萘啶酸、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢曲松和厄他培南的敏感率依次为61.11%、66.67%、68.52%、97.22%和100.00%。共检出3株NTS对头孢曲松不敏感，其中2株为ST11型肠炎血清型（Sa8709、Sa8771），1株为ST34型鼠伤寒血清型（Sa8763）。PFGE聚类分析显示，Sa8709和Sa8771菌株相似度较高（91.70%），但与Sa8763菌株相似度较低，为55.80%；Sa8709菌株携带CTX-M基因，Sa8771菌株携带CTX-M和TEM基因，Sa8763菌株携带OXA基因。结论 该地区临床分离NTS对氟喹诺酮类抗菌药物敏感率不高，出现了携带ESBLs基因的多重耐药菌株。

非伤寒沙门菌；多位点序列分型；脉冲场凝胶电泳；超广谱β-内酰胺酶；氟喹诺酮；抗药性，微生物；耐药性

［Chin J Infect Control，2016，15（4）：217—221］

全球非伤寒沙门菌（nontyphoidal Salmonella，NTS）感染呈现普遍上升趋势，美国每年约有100万例患者感染NTS［1］，我国每年因NTS感染所致急性腹泻患者约823.5万例［2］。NTS主要引起急性胃肠炎，约6%的患者可发展为败血症而威胁生命［3］。NTS是细胞内生存菌，某些抗菌药物虽然对其有体外活性但无临床疗效，可供临床选用的药物主要包括氨苄西林、复方磺胺甲口恶唑、氟喹诺酮类（FQs）和头孢曲松等。近年来，NTS对抗菌药物耐药率明显上升，美国疾病控制与预防中心（CDC）将NTS耐药威胁列为“严重”级别。近期国内少有临床分离NTS对抗菌药物耐药监测报道，本研究开展临床分离NTS的耐药监测，以及对头孢曲松耐药机制的初步探讨，为NTS感染防治和临床合理使用抗菌药物提供依据。

1　材料与方法

1.1菌株来源 选取2014年5—10月天津医科大学第二医院和天津医科大学总医院肠道门诊的急性腹泻患者粪便标本分离的108株非重复NTS。按照《食品卫生检验方法微生物学部分》GB/4789-2010中肠道致病菌检验方法进行分离培养，API 20 E试纸条进行生化鉴定。

1.2药敏试验 按照美国临床实验室标准化协会（CLSI）2013年抗微生物药物敏感性试验执行标准中K-B纸片扩散法和微量肉汤稀释法进行药敏试验［4］。药敏纸片包括氨苄西林、四环素、氯霉素、复方磺胺甲口恶唑、链霉素、环丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、头孢曲松、头孢他啶和厄他培南11种抗菌药物。厄他培南药敏纸片由赛默飞世尔科技有限公司提供，其余均购自北京天坛药物生物技术开发公司。质控菌株为本研究所保存的大肠埃希菌ATCC25922。多重耐药［5］为对3类或3类以上抗菌药物耐药。

1.3对头孢曲松不敏感NTS菌株的相关检测

1.3.1血清学分型 沙门菌血清诊断试剂盒为丹麦国立血清研究所产品，参照试剂盒说明书步骤和

食品安全国家标准中食品微生物学检验沙门菌方法（GB/T4789.4-2010），根据测定得到的抗原结果，比对Kauffmann-White抗原表确定菌株的血清型［6］。

1.3.2 脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型 PFGE分型按照美国CDC推荐的分型方案进行，PFGE成像结果采用BioNumerics软件进行聚类分析。分型标准质控菌株为布伦登卢普沙门菌H9812。

1.3.3多位点序列分型（MLST） 将MLST网站（http：//mlst.ucc.ie）上公布的沙门菌属的7个管家基因（thrA、purE、sucA、hisD、aroC、hemD、dnaN）作为本实验的目的基因，采用煮沸法提取细菌DNA模板，PCR反应体系及反应条件参照文献［6］。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，测序由英潍捷基技术有限公司进行。测序结果提交至MLST网站，得到菌株的等位基因谱和对应的ST分型。

1.3.4超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）和AmpC基因检测 选取对头孢曲松不敏感的NTS菌株（Sa8709、Sa8771、Sa8763）和敏感菌株（Sa8690）进行ESBLs基因（CTX-M、TEM、SHV、OXA）及AmpC基因（CMY、ACC进行）检测，引物序列、PCR反应体系和条件参照文献［7］。对PCR扩增阳性产物进行测序分析，以确保扩增产物的特异性和准确性，用敏感菌株Sa8690作为阴性质控。合成引物与测序公司同前。

2　结果

2.1NTS基本情况 共分离108株非重复NTS，其中88株来自天津医科大学第二医院，20株来自天津医科大学总医院。患者平均年龄36.6（17～88）岁；男性66例（61.11%），女性42例（38.89%）。

2.2 NTS药敏结果 108株NTS对11种抗菌药物的单药耐药率为49.07%（53/108），多重耐药率为17.59%（19/108）。对萘啶酸、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢曲松和厄他培南的敏感率依次为61.11%、66.67%、68.52%、97.22%和100.00%。详见表1。

表1　108株NTS对11种抗菌药物的药敏结果Table 1 Antimicrobial susceptibility testing results of 108 NTS isolates to 11 kinds of antimicrobial agents

2.3对头孢曲松不敏感的NTS菌株

2.3.1基本情况 共有3株NTS对头孢曲松不敏感，均为MDR菌株，其中2株耐药菌株为Sa8709 和Sa8771，1株中介为Sa8763。Sa8709菌株分离自天津医科大学第二医院，对氨苄西林、萘啶酸、头孢曲松耐药，对环丙沙星中介耐药；Sa8771菌株分离自天津医科大学总医院，对氨苄西林、链霉素、萘啶酸、头孢曲松、头孢他啶耐药，对环丙沙星和左氧氟沙星中介；Sa8763菌株分离自天津医科大学总医院，对头孢曲松中介，对氨苄西林、萘啶酸、左氧氟沙星、环丙沙星、氯霉素、四环素耐药。

2.3.2血清学分型结果 耐药菌株Sa8709和Sa8771均为肠炎血清型（Salmonella enterica），中介耐药菌株Sa8763为鼠伤寒血清型（typhimurium Salmonella）。

2.3.3PFGE分型结果 聚类分析显示，3株对头孢曲松不敏感NTS菌株的PFGE带型不同，Sa8709和Sa8771菌株相似度较高，为91.70%；Sa8709和Sa8771菌株与Sa8763菌株相似度较低，为55.80%。见图1。

图1　3株对头孢曲松不敏感NTS PFGE聚类分析图谱Figure 1 Clustering analysis of PFGE of 3 non-ceftriaxone-susceptible NTS isolates

2.3.4MLST结果 Sa8709、Sa8771和Sa8763菌株均能扩增出预期长度的7个管家基因DNA片段。见图2。将测序结果提交至MLST网站数据库进行比对，显示Sa8709和Sa8771菌株的7个管家基因aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA、thrA的等位基因谱依次均为5、2、3、7、6、6、11，对应的MLST分型均为ST11型；Sa8763菌株的等位基因谱依次为10、19、12、9、5、9、2，对应的分型是ST34型。

图2　3株对头孢曲松不敏感NTS 7个管家基因PCR产物电泳图Figure 2 Electrophoresis results of PCR products of 7 housekeeping genes in 3 non-ceftriaxone-suscep—tible NTS isolates

2.3.5ESBLs和AmpC基因检测结果 Sa8709、Sa8771菌株CTX-M基因，Sa8771菌株TEM基因，Sa8763菌株OXA基因均扩增到符合预期长度的基因片段。测序结果显示，Sa8709、Sa8771菌株的CTX-M基因片段序列与肠炎沙门菌Hd63的CTX-M序列（GenBank NO.NG036027）相似性为99%；Sa8771菌株的TEM基因片段序列与肠炎沙门菌D7795的TEM序列（GenBank NO.LN879484）相似性为100%；Sa8763菌株OXA基因片段序列与鼠伤寒沙门菌ST0653的OXA序列（GenBank NO.KT334335）相似性为98%。阴性对照Sa8690菌株未扩增出上述任何耐药基因。见图3。

图3　ESBLs和AmpC基因PCR产物电泳图Figure 3 Electrophoresis results of PCR products of ESBLs and AmpC genes

3　讨论

NTS与伤寒沙门菌不同，主要引起自限性胃肠炎，但是部分患者可出现严重并发症，如败血症、局灶感染等，幼儿、老人、免疫功能低下以及有血管内植入物等患者是高风险人群。美国每年因NTS感染导致约2万例住院患者，以及近400例患者因此而死亡［1］。FQs被认为是经验治疗NTS感染非常有效的药物，但是在某些地区耐药率明显上升［3］。近年来，发现若NTS对萘啶酸耐药，会导致FQs临床治疗失败或者反应延迟，故FQs不适于萘啶酸耐药的NTS感染［4］。2013年美国临床实验室标准化协会（CLSI）标准指出，萘啶酸耐药可用于预测FQs耐药或者敏感性降低，并且为了更好地反映临床疗效，采用新的标准判定环丙沙星和左氧氟沙星对NTS的敏感性，部分既往判断为敏感的菌株按照新标准会判定为中介［4］。本研究发现，本地区NTS对萘啶酸的耐药率达38.89%，对环丙沙星和左氧氟沙星的敏感率仅为68.52%和66.67%。国内多个地区前期报道显示，NTS对萘啶酸的耐药率较高，约为45%～85%［8—10］。以上数据提示我国临床NTS对FQs敏感性降低的菌株比例较高，并且涉及多个地区，因此应考虑重新评估FQs在我国是否仍适用于经验治疗NTS感染。

头孢曲松是治疗NTS感染非常重要的替代药物，虽然临床分离NTS对头孢曲松耐药比率仍较低，但是呈现上升趋势。2014年CHINET［11］对来自17所教学医院的菌株检测发现，肠炎血清型沙门菌和鼠伤寒血清型沙门菌对头孢曲松的耐药率分别为10.60%和11.40%。NTS对头孢曲松耐药的主要机制是携带ESBLs基因（CTX-M、TEM、SHV和OXA等）和/或AmpC基因（CMY和ACC等）［12—14］。PCR扩增和序列分析表明，本研究中3株对头孢曲松耐药的NTS，其中1株携带CTX-M基因，1株同时携带CTX-M和TEM基因，1株中介菌株携带OXA基因，均属于ESBLs基因；未检出AmpC基因。值得关注的是，肠炎型和鼠伤寒型NTS是引起人体感染的主要血清型，并且常导致暴发。本地区曾有肠炎血清型ST11型沙门菌造成感染暴发的报道［5］。本研究中对头孢曲松耐药或中介菌株为肠炎型和鼠伤寒型NTS，不仅对头孢曲松不敏感，而且对FQs耐药或中介，若引起感染暴发，则治疗将更为困难，危害更加严重。

PFGE是目前细菌基因分型的“金标准”，而MLST分型则能够反映菌株之间的进化和亲缘关系。本研究中对头孢曲松耐药NTS菌株（Sa8709、Sa8771）为肠炎血清型，其PFGE谱型不同，属于不同的克隆株，但二者均为肠炎血清型ST11型，说明在遗传学上有关联，而且PFGE谱型相似度较高为91.70%，提示可能由同一克隆株进化而来。

本地区临床分离NTS菌株对复方磺胺甲口恶唑、氯霉素的敏感率较高，可能与这些药物较少使用有关。近年来，阿奇霉素被发现对NTS有较好的临床疗效，但是已开始有耐药菌株的报道。特别强调的是，NTS感染大部分为自限性，仅高危患者才需要使用抗菌药物治疗，临床医生应把握适宜指征。NTS感染主要是食源性，畜牧养殖业也应该尽量减少使用不必要的抗菌药物，其为抗菌药物合理使用中不可缺少的组成部分。

综上所述，本地区临床分离NTS对FQs敏感率不高，出现了携带ESBLs基因的MDR菌株，应高度重视抗菌药物在各个行业的合理应用，并需要更为广泛深入的监测与研究。

致谢：感谢中国疾病预防控制中心腹泻病研究室和天津医科大学总医院感染性疾病科对本研究提供的大力支持和帮助。

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（本文编辑：刘思娣）

Antimicrobial resistance and mechanisms of ceftriaxone resistance in clini-cally isolated nontyphoidal Salmonella

SHI Wei，XIA Lin-lin，LIU Xiao-xia，HAN Shuang—yu，YANG Jie，ZHAO Zhan，WANG Yu-bao（Institute of Infectious Diseases，The Second Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin300211，China）

Objective To investigate antimicrobial resistance and ceftriaxone resistance mechanisms in clinically isolated nontyphoidal Salmonella（NTS），and provide evidence for the prevention and control of NTS infection and rational use of antimicrobial agents.Methods 108 NTS isolates were isolated from stool specimens of outpatients with acute diarrhea in the Second Hospital of Tianjin Medical University and Tianjin Medical University General Hospital from May to October of 2014，NTS were performed antimicrobial susceptibility testing；non-ceftriaxone-susceptible isolates were typed by serological，multilocus sequence（MLST），and pulsed-field gel electrophoresis （PFGE）methods，extended-spectrumβ-lactamase（ESBL）detection and AmpC genes were detection.Results Among108 NTS isolates，mono-drug resistance rate to 11 antimicrobial agents was 49.07%（n=53），multidrug resistance rate was17.59%.Susceptibility rates to nalidixic acid，levofloxacin，ciprofloxacin，ceftriaxone，and ertapenem were 61.11%，66.67%，68.52%，97.22%，and 100.00%respectively.Three non-ceftriaxone-susceptible NTS isolates were detected，2 were ST11 Salmonella enterica serotype（Sa8709，Sa8771），1 was ST34 Salmonella typhimurium serotype（Sa8763）.Cluster analysis of PFGE revealed that Sa8709 was highly similar to Sa8771 strains（91.70%），but the similarity to Sa8763 was low（55.80%）；Sa8709 strain carried CTX-M gene，Sa8771 strain carried CTX-Mand TEMgenes，Sa8763 strain carried OXAgene.Conclusion Clinically isolated NTS in this area are low resistant to fluoroquinolones，multidrug resistant strains carrying ESBLs have emerged.

nontyphoidal Salmonella；multilocus sequence typing；pulsed-field gel electrophoresis；extended-spectrumβ-lactamase；fluoroquinolone；drug resistance，microbial；drug resistance

R181.3+2 R378.2

A

1671—9638（2016）04—0217—05

10.3969/j.issn.1671-9638.2016.04.001

2015—12—25

天津市卫生局科研基金资助项目（2013KZ112）

师伟（1986—），男（汉族），河北省张家口市人，硕士研究生，主要从事细菌耐药及致病机制研究。

王玉宝 E-mail：wyb2046@163.com