四种提取方法提取黑鸡枞菌多糖的对比分析研究

李陈雪，曹　赢，曲炳楠，杨　婧

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)



四种提取方法提取黑鸡枞菌多糖的对比分析研究

李陈雪，曹赢，曲炳楠，杨婧

(黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040)

采用四种方法提取黑鸡枞菌中的多糖，从而优选出最佳方法.通过对未粉碎、普通粉碎、超微粉碎、超微粉碎联合超声法四种不同提取工艺进行对比研究，确定超微粉碎联合超声法对黑鸡枞菌多糖的提取率具有显著地提高作用.结果表明,超微粉碎得到200目黑鸡枞菌超微粉末，超声提取2 h，提取功率600 W，提取物进一步纯化得到提取率为14.43%的精制黑鸡枞菌多糖.超微粉碎联合超声法是提取黑鸡枞菌中多糖的理想方法.

鸡枞菌多糖；超微粉碎；超声提取

鸡枞菌(Termitomyces albuminosus)，又叫鸡丝菇、白蚁菇、三坛菌.隶属于担子菌亚门(Basidiomycotina)，层菌纲(Hymenomycetes)，伞菌目(Agaricales)，口蘑科(Tricholomataceae)是一类美味的野生菌[1-2].其中，黑鸡枞有养血、润燥、健脾胃等功效.本文采用四种不同的提取方法对黑鸡枞菌的多糖的提取展开研究.为提高黑鸡枞菌多糖的提取率，将传统的水提醇沉法进行改进，采用先进的超微粉碎联合超声波辅助提取黑鸡枞菌中的多糖，实验结果表明超微粉碎联合超声法是提取黑鸡枞菌中多糖的理想方法.

1　实验仪器与材料

黑鸡枞菌(购自云南省昆明市，经黑龙江中医药大学中化教研室鉴定合格)；葡萄糖、硫酸、苯酚等均为国产分析纯试剂(天津市科密欧化学试剂开发中心)；UV-2000 型紫外可见分光光度仪(尤尼科仪器上海有限公司)；电子调温电热套(北京市永光明医疗仪器厂)；离心沉淀机(上海医用分析仪器厂)；冷冻干燥机(VirTis Benchtop 2K)；其它试剂均为分析纯.

2　黑鸡枞菌多糖的含量测定方法的建立

2.1供试品溶液的制备

取黑鸡枞菌提取物10 mg，置于50 mL容量瓶，加蒸馏水定容至刻度，以3 000 r/min离心20 min，取上清液.精密移取提取液2 mL，定容至10 mL，混匀即得.

2.2对照品溶液的制备

精密称取10 mg于105 ℃烘箱中干燥恒重的无水葡萄糖，置于100 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，即得质量浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液.

2.3最大吸收波长的测定

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各1 mL，分别置于20 mL具塞试管中，加入5%苯酚溶液1 mL，混匀，加入浓硫酸5 mL，迅速混匀，置沸水浴，20 min后取出置于冷水浴5min.以相应试剂为空白，在分光光度仪上进行全波长扫描.

2.4标准曲线的制备

精密吸取对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL溶液加入具塞试管中，补加蒸馏水至1 mL，加入5 mL浓硫酸和1 mL的5%苯酚溶液，沸水浴加热15 min，冷却至室温.用同样方法处理的蒸馏水作为空白溶液，在210 nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线，得线性回归方程y= 0.009x- 0.028，R2= 0.999 3，线性范围为20～80 μg/mL.

2.5黑鸡枞菌多糖提取率的计算

提取物中黑鸡枞菌多糖含量=[(黑鸡枞菌多糖计算量/提取物称取量)×100%]×提取物总量；

提取率(%)=(提取物黑鸡枞菌多糖含量/黑鸡枞菌量)×100%.

2.6水提醇沉法提取黑鸡枞菌多糖工艺

取一定量黑鸡枞菌，加热回流提取1 h，过滤去除上清液后浓缩，浓缩液加入5倍体积的95%乙醇，冰箱冷藏静置24 h后过滤[3].经无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤沉淀，采用冷冻干燥法，在箱体压力抽至30～60 Pa，冻干制品-30 ℃左右的条件下，历时48 h冻干得到黑鸡枞菌粗多糖.将所得粗多糖配制成2 mg/mL的水溶液，加入其1/5体积的氯仿—正丁醇(4∶1)混合溶液，充分震荡30 min，经离心去除沉淀.再取上清液，向其中加入1/5体积的氯仿-正丁醇混合溶液，重复2～3次，直至无明显沉淀产生，即采用Sevag法获得精制的黑鸡枞菌多糖.

2.7不同粉碎工艺对黑鸡枞菌多糖提取的影响

以黑鸡枞菌多糖的提取率为指标，下面分别对未粉碎、普通粉碎、超微粉碎、超微粉碎联合超声法四种不同提取工艺进行对比，考察不同粉碎度对多糖提取的影响.

未粉碎黑鸡枞菌提取工艺 将干黑鸡枞菌原药材50 g，直接按2.3项下提取，计算黑鸡枞菌多糖提取率.

普通粉碎提取工艺 将冷冻干燥法脱水干燥的黑鸡枞菌原药材放入微型粉碎机中粉碎5 min，过40目筛后，取50 g粉碎物按2.3项下提取，计算黑鸡枞菌多糖提取率.

超微粉碎提取工艺 将采用冷冻干燥法脱水干燥的黑鸡枞菌原药材放入振动式超微粉碎机中粉碎20 min，过200目筛，取50 g微粉，按2.3项下工艺制备黑鸡枞菌多糖，计算黑鸡枞菌多糖的提取率.

2.8超微粉碎联合超声法提取黑鸡枞菌多糖工艺

将采用冷冻干燥法脱水干燥的黑鸡枞菌原药材，放入振动式超微粉碎机中粉碎20 min，筛分出200目微粉50 g，将鸡枞菌粉碎物加入含20倍蒸馏水的圆底烧瓶中，超声2 h后过滤去除上清液，再加入30倍蒸馏水在90～100 ℃加热回流8 h，收集提取液.提取物经粗滤后，将滤液放置离心沉淀机中，以4 000 r/min的转速将浸提液离心10 min，取上清液，加热浓缩至200 mL，加入3倍体积的95%乙醇，经离心取多糖沉淀，再用无水乙醇进一步脱水，所得沉淀物溶于适量水中[4].将溶液放入冰箱预冻48 h，放入冷冻干燥机中冷冻干燥48 h，得到黑鸡枞菌多糖提取物冻干制品.进而采用Sevag法除去杂质，获得精制多糖[4].

3　实验结果

3.1黑鸡枞菌多糖的检测

3.1.1苯酚硫酸法

采用苯酚硫酸法检测，可见含有多糖溶液的试管呈红棕色，而不含多糖的试管中无明显颜色变化.

3.1.2紫外分光光度法测定

采用紫外分光光度法测定得到吸收谱图在200 nm处可见明显吸收峰.(见图1)

图1　UV-可见全波长扫描图谱

3.2提取工艺的确定

分别采用超微粉碎联合超声、超微粉碎、普通粉碎及未粉碎黑鸡枞菌四种提取工艺，以黑鸡枞菌多糖的提取率为指标，考察不同提取工艺对黑鸡枞菌多糖提取的影响，实验结果见表1 .

表1　四种提取工艺对提取率的影响对比

由表1可知三种粉碎粒度中，普通粉碎比未粉碎黑鸡枞菌工艺的提取率有并不明显的提高，而超微粉碎提取工艺比二者的提取工艺提高较多，而以超微粉碎联合超声提取法开展黑鸡枞菌的提取更有利于黑鸡枞菌中多糖的提取.

4　结　语

通过对比实验数据可知，超微粉碎对于提取率的提高有较明显的提升作用.探究其原因，可能是因为超微粉碎破坏植物的细胞壁能更为彻底，更有利于多糖的提取.

实验中黑鸡枞菌多糖最终的平均提取率稳定在14%以上.对黑鸡枞菌多糖的提取乃至此类菌类的多糖提取均有较大的借鉴意义.

[1]KIRK P M, CANNON P F, DAVID J C,etal. Ainsworth & Bisby ’ sdictionary of the fungi[M]. Wallingford, UK: CAB1 Publishing, 2001.

[2]KANSCI G, MOSSEBO D C, SELATSA A B,etal. Nutrient content of some mushroom species of the genus Termitomyces consumed in Cameroon[J]. Food / Nahrung, 2003, 47(3): 213-216.

[3]谭晓虹, 方秀梅. 云南产鸡枞菌多糖含量测定[J].张家口医学院学报, 2004, 21(1): 2-3.

[4]杨婧, 张帅, 王冬梅, 等. 超微粉碎联合超声法提取红花中多糖工艺研究[J].哈尔滨商业大学学报:自然科学版, 2014, 30(3): 354-356.

Comparative study on extraction of polysaccharides from Termitomyces albuminosus by different preparation technology

LI Chen-xue, CAO Ying, QU Bing-nan, YANG Jing

(Heilongjiang University of Chinese Traditional Medicine, Harbin 150040,China)

Black Termitomyces albuminosus polysaccharide was extracted by the best method of four methods. Four different extraction processes were compared including not crushed,ordinary grinding, ultrafine grinding,superfine grinding method combined with ultrasound. The ultramicro pulverization method combined with ultrasound could significantly improve the effect on black Termitomyces albuminosus polysaccharide extraction rate. Results indicated that Ultramicro smashing could get 200 mesh black Termitomyces albuminosus ultrafine powder,ultrasonic extraction 2 h,extraction power 600 W.The extraction was further purified extraction rate of polysaccharides to14.43% of refined black Termitomyces. Ultrafine grinding method combined with ultrasound is an ideal method for extract polysaccharide from black Termitomyces albuminosus.

Black Termitomyces albuminosus; ultrafine grinding; ultrasonic extraction

2015-09-21.

国家自然科学基金(81473359)

李陈雪(1991-)，女，硕士，研究方向：中药新药与新剂型研究.

杨婧(1981-)，女，博士，副教授，研究方向：中草药防治肿瘤.

TQ461

A

1672-0946(2016)04-0403-03