催化蔗糖-6-乙酸酯合成的微生物筛选和培养条件优化

孙杰，陈梁，娄波，白彦兵，汪钊

（1.亿帆鑫富药业股份有限公司博士后科研工作站，浙江临安311300；2.浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）

催化蔗糖-6-乙酸酯合成的微生物筛选和培养条件优化

孙杰1，2，陈梁1，娄波1，白彦兵1，汪钊2

（1.亿帆鑫富药业股份有限公司博士后科研工作站，浙江临安311300；2.浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州310014）

三氯蔗糖是目前最优秀的功能性甜味剂之一，其合成的关键步骤是蔗糖-6-乙酸酯的合成。从土壤中分离到一株能够在有机溶剂中催化合成蔗糖-6-乙酸酯的杆状细菌，命名为WZS01。对该菌株的培养基和培养条件进行了初步优化，在2.5%葡萄糖，1%蛋白胨，0.1%酵母粉培养基中，以聚氨酯泡沫作为菌体固定化基质，30℃培养18 h。将吸附有菌体的聚氨酯泡沫干燥后作为催化剂，在2%底物浓度下，在二甲基甲酰胺/叔丁醇反应介质中催化18 h，蔗糖-6-乙酸酯的摩尔产率达到83.3%，并通过红外和核磁确认了产物结构。

三氯蔗糖；蔗糖-6-乙酸酯；固定化细胞；聚氨酯泡沫

三氯蔗糖是一种基于蔗糖合成的新型甜味剂，具有甜度高、味质好、储存期长、无热量和安全性高等优点。三氯蔗糖合成的关键步骤是蔗糖-6-乙酸酯的合成。目前蔗糖-6-乙酸酯的合成以化学法为主，化学法反应条件苛刻、区域选择性较差、容易生成副产物，导致合成产物纯度较低，影响了产品的质量［1-2］。酶催化反应因为具有区域选择性强、反应条件温和等诸多优点，成为了蔗糖酯选择性合成中的研究热点。能特异性酯化蔗糖6位羟基的脂肪酶菌种来源有假单胞菌［3］、米黑毛霉［4］和柔毛腐质霉［5］，主要用于合成长链酯。能够高效合成短链的蔗糖-6-乙酸酯的脂肪酶种类还较少。王等［6］使用诺维信公司固定化脂肪酶Lipozyme TLIM，以乙酸乙烯酯作为酰基供体，二甲基亚砜（DMSO）作为蔗糖助溶剂，合成的蔗糖-6-乙酸酯得率将近90%。上述Lipozyme TLIM脂肪酶来自于疏棉状嗜热丝孢菌，是目前报道的催化蔗糖合成蔗糖-6-乙酸酯效果最好的商品化脂肪酶。但是商品化脂肪酶成本较高，无法应用于实际生产中。

本课题组筛选得到了一株能够以二甲基甲酰胺（DMF）作为蔗糖助溶剂合成蔗糖-6-乙酸酯的产酶菌株，编号为WZS01。在三氯蔗糖合成过程中，蔗糖-6-乙酸酯合成之后，需要在DMF存在下进行氯化反应，因而DMF无需去除。进一步通过单因素法对该菌株的培养基成分和发酵条件进行了初步优化，以提高其产酶活性。蔗糖-6-乙酸酯的合成需要在无水的有机相中进行，我们使用固态基质在培养过程中对细胞进行了固定化，为制备高效、专一的生物催化剂及其以后的工业化应用奠定基础。

1　材料与方法

1.1试剂

蔗糖-6-乙酸酯标品购于Sigma公司；三丁酸甘油酯、叔丁醇、4Å分子筛购于上海阿拉丁生化公司；其他试剂均为市售分析纯。

1.2培养基

LB液体培养基（W/V）：酵母提取物0.5%，蛋白胨0.1%，氯化钠0.1%。115℃灭菌30min。

液体富集培养基（W/V）：橄榄油3.0%，Tween-80 0.5%，（NH4）2SO40.50%，K2HPO40.35%，KH2PO40.10%，NaCl 0.25%，MgSO4·7H2O 0.05%。

初筛平板培养基（W/V）：三丁酸甘油酯2.0%，（NH4）2SO40.50%，K2HPO40.35%，KH2PO40.10%，NaCl 0.25%，MgSO4·7H2O 0.05%，琼脂粉1.5%。115℃灭菌30min。灭菌后，在100mL培养基中，加入0.1 g溴百里酚蓝作为酸碱指示剂，混匀，60℃左右倒平板，冷却凝固。

初始培养基（W/V）：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉0.1%。115℃灭菌15min。（注：在每批培养基优化实验中，均保留了0.1%的酵母粉，是为了保留其中所含的微生物生长发育所需的生长因子）。

1.3方法

1.3.1菌株筛选

将1 g采集的土样溶于10 mL无菌水中，静置后取0.1 mL上层液体接入5 mL LB液体培养基中，30℃培养过夜。取1 mL过夜培养物，加至20 mL液体富集培养基中，30℃、180 r/min振荡培养24 h。将富集菌液稀释108倍，取100μL稀释液涂布于初筛平板上，30℃培养箱中培养一天。挑取菌落颜色变为黄色的不同形态的单菌落，接种至含橄榄油的液体富集培养基中，30℃、180 r/min振荡培养过夜。

吸取1 mL上述菌液于离心管中，离心、烘干菌体，加入含10%蔗糖的DMF 0.2mL，叔丁醇0.8mL，乙酸乙烯酯0.056mL，30℃反应1 h合成蔗糖-6-乙酸酯。该反应过程中释放乙醛，使用Zheng等［7］的显色方法，可以对乙醛定量，从而反映出酶活力的大小。取20倍稀释的反应液100 μL，加入100μL 0.1%酚试剂，反应10 min，再加入40μL 0.1 mol/L盐酸配制的质量分数为1%的NH4Fe（SO4）2·12H2O试剂，反应30 min；酶标仪测定OD598。将OD值较高的菌种，培养后进行蔗糖-6-乙酸酯催化反应，反应24 h，液相测定产物谱。

1.3.2菌体细胞培养条件优化

将菌株WZS01接种于5 mL的培养基中，30℃、200 r/min恒温摇床培养12 h。取0.5mL种子液，接入50mL的初始培养基中。采用单因素实验的方法，分别从发酵碳源、氮源、发酵温度和发酵时间等方面研究不同因素对菌株WZS01产酶的影响，以探究菌株的最佳培养基配方和最适发酵产酶条件。如无特别说明，所有实验均重复三次。

1.3.3菌体细胞固定化

聚氨酯泡沫是生活中常见的包装和装饰材料，本实验使用聚氨酯泡沫作为固定化载体。将其切割成尺寸为1 cm3的小块，在去离子水中煮沸后，烘箱干燥。向50mL培养基中加入0.4 g切成小块的聚氨酯泡沫作为固定化基质，115℃灭菌15min，冷却后接种1%的WZS01种子液，30℃培养。

1.3.4生物转化条件

发酵结束后，取出聚氨酯泡沫，挤净培养基，干燥后取0.2 g作为催化剂，反应体系包括底物蔗糖0.2 g，DMF 2 mL，叔丁醇8mL，乙酸乙烯酯0.56 mL，30℃反应18 h。

1.3.5产物结构鉴定与浓度测定

将1 g蔗糖溶于50 mL溶剂（V（DMF）∶V（叔丁醇）=1∶4）中，加入0.8 g吸附有WZS01菌的聚氨酯泡沫，2.8mL乙酸乙烯酯，32℃反应24 h。反应结束后离心，取上清。60℃低压蒸馏去除叔丁醇，向得到的含有蔗糖6酯的DMF溶液中加入4倍体积的二氯甲烷，离心收集沉淀，即为蔗糖-6-乙酸酯粗品。

取0.4 g粗品用硅胶G层析柱纯化，洗脱液为V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（水）=8∶1∶1，流速为0.8 mL/min，收集流出液，60℃下真空浓缩。

使用Bruker Tensor 27红外光谱分析仪（KI压片法）和Bruker VANCE III核磁共振仪（400 MHz），确定产物结构。

使用Waters 2695高效液相色谱，测定蔗糖-6-乙酸酯含量，液相检测条件为Diamonsil®C18（5 μm，250 mm×4.6 mm）柱，流动相为V（乙腈）∶V（甲醇）∶V（水）=8∶1∶1，流速1.0 mL/min，温度35℃，示差检测器。

2　结果与讨论

2.1菌种筛选

在有机溶剂存在时，大多数微生物几乎丧失代谢功能并停止生长，而且酶在有机溶剂中变性或失活，而脂肪酶对有机溶剂具有一定的耐受性，可以使用脂肪酶或者合成脂肪酶的微生物细胞作为催化剂，在非水相中进行酶促反应。在本研究中，我们对300份土样进行了大量的分离筛选工作，最终筛选出一株能够催化合成蔗糖-6-乙酸酯的菌株，命名为WZS01。该菌株菌落为白色、半透明、光滑湿润，革兰氏染色菌体为紫色，为革兰氏阳性菌，杆状。下面进一步对该菌株的培养基和培养条件进行初步优化。

2.2最适碳源及浓度的确定

碳源是微生物生存的一类基础营养物，不同的碳源导致微生物生长发育状态不同，产酶体系也随之变化。在2%葡萄糖，2%蛋白胨，0.1%酵母粉培养基基础上更改，本实验根据实验室现有的各种碳源进行了单因素实验。分别以2%的乳糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘油作为碳源。菌株WZS01 30℃培养24 h，取0.5mL培养物干燥后进行反应，5mL反应体系，反应30 min，按Zheng等［7］的方法，测定相对反应初速度。

图1（a）结果显示：不同的碳源对菌体产脂肪酶的影响较大，麦芽糖、淀粉和甘油作为碳源时，酶活性较低；而以葡萄糖、乳糖或蔗糖为碳源时，菌体酶活性较好，其中葡萄糖最好。因此选择葡萄糖作为最优碳源。

进一步考察了葡萄糖浓度对菌株WZS01产酶的影响。从图1（b）可以看出：随着葡萄糖浓度的升高，菌株的产酶活性先升高后降低；当葡萄糖浓度达到2.5%时，反应初速度达到了最大值；当葡萄糖浓度继续提高至4.0%时，酶活显著降低。分析这一现象的原因，可能是发酵培养基中葡萄糖浓度过高，菌体生长代谢活动旺盛，容易引起菌种衰老，并且不利于菌体脂肪酶的合成。综合以上因素，本实验选择2.5%的葡萄糖浓度作为最适碳源浓度。

2.3最适氮源及浓度的确定

氮源是微生物合成蛋白质、核酸等物质的重要营养来源，不同氮源和浓度对菌体的生长和发酵产酶有重要影响。在碳源为葡萄糖，浓度为2.5%条件下，本实验选择添加1%的有机氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、玉米粉）或无机氮源（硫酸铵、硝酸钠、氯化铵），考察不同氮源对菌株WZS01产酶的影响，结果如图2所示。图2（a）显示：该菌株对有机氮源的利用效果优于无机氮源，以牛肉膏、蛋白胨或酵母粉为氮源时，产酶活性高；以蛋白胨作为氮源时，菌株合成蔗糖-6-乙酸酯的反应初速度最大，即产酶效果最佳。因此，选择蛋白胨作为最适氮源。

实验进一步考察了蛋白胨浓度对菌株WZS01发酵及产酶的影响。由图2（b）可知：当蛋白胨浓度为1%时，酶活最高；蛋白胨浓度再提高，酶的活性也稍有降低。本实验选择1%蛋白胨作为最适氮源浓度。

2.4最适发酵温度确定

发酵温度对微生物生长和酶的活性具有显著影响。温度对发酵过程的影响及调节控制是影响微生物生长繁殖的重要因素之一。在以上实验的基础上，本实验以2.5%的葡萄糖作为碳源，1%的蛋白胨作为氮源，摇床转速为150 r/min，分别以26、28、30、32、34和36℃恒温培养24 h。之后取相同体积发酵液离心，烘干菌体，考察不同发酵温度对菌株WZS01产酶的影响，结果如图3所示。30℃培养时，单位体积发酵液的蔗糖-6-乙酸酯催化活性最高。

2.5细胞固定化

细胞固定化可以增强酶在有机溶剂反应体系中的稳定性，提高底物转化效率。将密度接近10、30和50 kg/m3的聚氨酯泡沫小块与菌体30℃共同培养18 h。称取干燥后的吸附有菌体的聚氨酯泡沫小块0.2 g作为催化剂，反应体系为蔗糖0.2 g，DMF 2mL，叔丁醇8mL，乙酸乙烯酯0.56mL，反应时间18 h，在相同条件下以0.2 g干燥的游离菌体细胞作为对照进行反应，蔗糖-6-乙酸酯产率如图4所示。实验结果表明：使用聚氨酯泡沫固定化菌体细胞，可以大幅度提高蔗糖-6-乙酸酯的产率；其中低密度聚氨酯泡沫吸附的菌体较高密度聚氨酯泡沫更多，因而催化蔗糖-6-乙酸酯的产率更高。以密度10 kg/m3的聚氨酯泡沫为固定化载体，放入培养基中与菌体一同培养不同时间，结果表明培养18 h得到的固定化细胞蔗糖-6-乙酸酯产率较其他时间更高（图5）。

2.6蔗糖-6-乙酸酯的纯化与鉴定

使用上述细胞固定化方法和催化条件，得到纯度为86.1%的蔗糖-6-乙酸酯粗品。进一步取0.4 g粗品用硅胶G层析柱纯化，真空浓缩后，得到0.15 g蔗糖-6-乙酸酯，纯度为96%。

红外光谱分析（KI压片法）：3 392.81（-OH），2 924.90（烷烃饱和C-H），1 729.35（C=O），1 253.88（酯基C-O），1 046.28（C-O-C），927.97（α-糖苷键）。

核磁共振分析13C图谱结果：13C NMR （C2D6SO，400 MHz）：170.85（-COCH2），103.91（C2′），91.58（C1），82.75（C5′），77.12（C3′），74.66（C4′），72.88（C3），71.63（C2），70.34（C5），70.17（C4），63.95 （C′），62.74（C6′），62.43（C1′），20.84（-COCH2）。

上述图谱符合蔗糖-6-乙酸酯的结构特征，与Yang等［8］的报道一致。

3　结论

在三氯蔗糖合成过程中，蔗糖-6-乙酸酯合成后，需要在DMF存在下进行氯化反应。我们筛选得到了一株能够以DMF作为蔗糖助溶剂合成蔗糖-6-乙酸酯的产酶菌株，编号为WZS01。DMF可以在下一步氯化步骤中继续使用，无需去除。在2.5%葡萄糖，1%蛋白胨，0.1%酵母粉培养基中，以聚氨酯泡沫作为菌体固定化基质，30℃培养18 h。将吸附有菌体的聚氨酯泡沫干燥后，在0.2 g蔗糖，2 mL DMF，8 mL叔丁醇，和0.56mL乙酸乙烯酯的反应体系中催化18 h，蔗糖-6-乙酸酯的摩尔产率达到83.3%。本研究为制备WZS01全细胞生物催化剂及其在三氯蔗糖制备过程中的应用，打下了坚实的基础。

［1］陈志刚，宗敏华，娄文勇.非水介质中酶促糖酯合成研究进展［J］.分子催化，2007，21（l）：90-95.

［2］李鹏飞，袁冰，毕晨光，等.合成蔗糖-6-酯的研究进展［J］.化工中间体，2006（6）：1-3，19.

［3］RICH JO，BEDELL B A，DORDICK JS.Controlling enzymecatalyzed regioselectivity in sugarester synthesis［J］.Biotechnology and bioengineering，1995，45（5）：426-434.

［4］KIM JE，HAN JJ，YOON JH，et al.Effect of salt hydrate pair on lipase-catalyzed regioselectivemonoacylation of sucrose［J］. Biotechnology and bioengineering，1998，57（1）：121-125.

［5］FERRER M，CRUCES M A，BERNABÉM，et al.Lipasecatalyzed regioselective acylation of sucrose in two-solvent mixtures［J］.Biotechnology and bioengineering，1999，65（1）：10-16.

［7］ZHENG Jianyong，FU Xiaofeng，YING Xiangxian，et al.A sensitive colorimetric high-throughput screening method for lipase synthetic activity assay［J］.Analytical biochemistry，2014，452（5）：13-15.

［8］YANG Xu’e，ZHENG Pu，NI Ye，et al.Highly efficient biosynthesis of sucrose-6-acetate with cross-linked aggregates of Lipozyme TL 100 L［J］.Journal of biotechnology，2012，161 （1）：27-33.

（责任编辑：朱小惠）

Screening of strains for sucrose-6-acetate synthesis and optim ization of culture conditions

SUN Jie1，2，CHEN Liang1，LOU Bo1，BAIYanbin1，WANG Zhao2
（1.Postdoctoral Research Station of Yi Fan Xin Fu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Linan 311300，China；2.College of Biotechnology and Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Sucralose is one of the best functional sweeteners currently.The key step of sucralose synthesis is preparation of sucrose-6-acetate.An organic solvent tolerant and rod-shaped bacterium WZS01，which can synthesize sucrose-6-acetate with sucrose as substrate was isolated. The media and culture conditions were optimized.The cells were immobilized on polyurethane foam after cultured 18 h in sterile medium containing glucose 2.5%，peptone 1%，and yeast extract 0.1%.The dried immobilized cells were used for sucrose-6-acetate synthesis in dimethyl formamide/tert butyl alcohol and the yield of sucrose-6-acetate reached 83.3%with 2%sucrose after 18 h reaction.The structure of sucrose-6-acetate was confirmed by IR and NMR.

sucralose；sucrose-6-acetate；immobilized cell；polyurethane foam

TQ92

A

1674-2214（2016）03-0147-05

2016-06-22

中国博士后基金项目（2014M561788）；浙江省2014年博士后科研择优资助项目

孙杰（1981—），男，内蒙古包头人，讲师，博士，研究方向为生物催化，E-mail：jsun@zjut.edu.cn.通信作者：汪钊教授，E-mail：hzwangzhao@163.com.