L-2-氨基丁酸生物合成研究进展

潘苟生，郑仁朝，郑裕国

（浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014）

L-2-氨基丁酸生物合成研究进展

潘苟生，郑仁朝，郑裕国

（浙江工业大学生物工程研究所，浙江杭州310014）

生物法因为具有立体选择性高、环境污染少、反应条件温和等特点，已成为合成L-2-氨基丁酸的重要方法。对近年来生物法（包括发酵法、氨基酰化酶法、氨基酸氧化酶法、酰胺酶法、腈水解酶法、转氨酶法和氨基酸脱氢酶法）合成L-2-氨基丁酸的路线和研究进展进行了综述，分析上述工艺中存在的问题并提出建议和对策，为实现L-2-氨基丁酸工业化生产和降低生产成本提供参考。

左乙拉西坦；L-2-氨基丁酸；微生物发酵；生物催化

L-2-氨基丁酸是一种非天然手性氨基酸，具有抑制人体神经信息传递、加强葡萄糖磷酸酯酶的活性和促进脑细胞代谢的作用。如图1所示：L-2-氨基丁酸及其衍生物（S）-2-氨基丁酰胺、（S）-2-氨基丁醇是多个手性药物（如抑菌抗结核药乙胺丁醇盐酸盐［1-2］、新型抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦等）的关键中间体［3］，在制药工业中应用广泛。随着左乙拉西坦等药物专利到期，市场普及程度提高，对其关键中间体L-2-氨基丁酸的需求量大幅增加。因此寻找一条生产效率高、环境污染少的L-2-氨基丁酸合成工艺已成为研究重点。目前，L-2-氨基丁酸的合成方法包括化学法和生物法。化学法包括以L-蛋氨酸为原料在脱硫剂Raney Ni作用下脱去甲硫基生成L-2-氨基丁酸的路线［4］和运用手性拆分试剂D-酒石酸等与外消旋2-氨基丁酸形成非对应异构体进行拆分得到L-2-氨基丁酸的路线［5］，但是化学法合成L-2-氨基丁酸反应条件苛刻、易生成副产物，同时大量使用有机溶剂易造成环境污染。生物法合成L-2-氨基丁酸具有立体选择性高、反应条件温和、环境污染少等特点，具有广阔的工业化开发前景。

1　L-2　-氨基丁酸生物合成方法

L-2-氨基丁酸的生物合成方法包括发酵法、氨基酰化酶法、氨基酸氧化酶法、酰胺酶法、腈水解酶法、转氨酶法和氨基酸脱氢酶法等。发酵法操作简单，但是发酵过程会产生与目标产物L-2-氨基丁酸结构类似的副产物丙氨酸等，后续产物分离提取较困难。酶法工艺具有催化效率高、副产物少等特点，主要包括动力学拆分、动态动力学拆分和不对称合成三种。相比于动力学拆分，其他两种方法理论转化可达100%。但是酶法工艺多面临着辅酶循环再生效率和酶稳定性低、工程放大难等问题。

1.1发酵法

大部分天然氨基酸都可以通过微生物发酵生产得到［6］，如L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸等年产量超过200多万吨［7］，但是微生物发酵法生产非天然氨基酸却相对复杂。Liao等［8-9］以30 g/L葡萄糖为底物，以高产L-苏氨酸的重组大肠杆菌Escherichia coli ATCC98082发酵生产L-2-氨基丁酸，产物浓度达到5.5 g/L。其合成途径如图2所示：大肠杆菌以葡萄糖为原料，首先合成L-苏氨酸，L-苏氨酸在异源表达的苏氨酸脱氨酶（脱水酶）和经过分子改造的谷氨酸脱氢酶（GDH）双酶催化下，合成L-2-氨基丁酸。

1.2氨基酰化酶法

该法以外消旋N-乙酰-DL-2-氨基丁酸为底物，使用氨基酰化酶拆分制备L-2-氨基丁酸。例如焦庆才、奚强等用乙酸酐乙酰化DL-2-氨基丁酸，得到N-乙酰-DL-2-氨基丁酸，再用L-氨基酰化酶拆分得到L-2-氨基丁酸；剩余的N-乙酰-D-2-氨基丁酸经消旋化后，再次用于酶拆分，最终得到光学纯L-2-氨基丁酸，收率71.8%，反应过程如图3所示［10-11］。

1.3氨基酸氧化酶法

徐红梅等［12］以外消旋DL-2-氨基丁酸为底物，利用固定化D-氨基酸氧化酶选择性氧化D-2-氨基丁酸，e.e.值达到99.5%。为了进一步提高产物收率，向体系中添加Pd-C/HCOONH4等化学还原剂能够将氧化脱氨过程中形成的过渡态α-亚氨基酸原位转化为DL-2-氨基丁酸，在D-氨基酸氧化酶的作用下进一步拆分，收率可达到85%，反应过程如图4所示。

1.4酰胺酶法

Yasukawa等［13］利用来源于Brevundimonas diminuta TPU 5720的酰胺酶催化（S）-2-氨基丁酰胺水解生成L-2-氨基丁酸。反应如图5所示：2-氨基丁腈首先经腈水合酶水合生成外消旋2-氨基丁酰胺，L-酰胺酶催化（S）-2-氨基丁酰胺水解生成L-2-氨基丁酸；剩余的（R）-2-氨基丁酰胺在外消旋酶的作用下再次形成外消旋体，进一步拆分后得到光学纯L-2-氨基丁酸，e.e.值大于99%。

1.5腈水解酶法

周海岩等［14］利用产腈水解酶的重组大肠杆菌立体选择性水解外消旋2-氨基丁腈合成L-2-氨基丁酸（图6）。在60mmol/L底物浓度下，产物质量浓度达到5.43 g/L，e.e.值大于99%。

1.6转氨酶法

以2-酮丁酸为底物通过转氨酶法合成L-2-氨基丁酸是目前报道较多的方法，由于2-酮丁酸价格较高，因此多以L-苏氨酸为出发底物，通过转氨酶与苏氨酸脱氨酶（也称苏氨酸脱水酶）耦联合成L-2-氨基丁酸。

Fotheringham等［15-16］在大肠杆菌中分别表达来源于大肠杆菌的苏氨酸脱氨酶、酪氨酸转氨酶和来源于枯草芽孢杆菌的乙酰乳酸合成酶。以苏氨酸为底物，天冬氨酸为氨基供体，建立了三酶不对称催化合成L-2-氨基丁酸的方法（图7）。L-苏氨酸首先在苏氨酸脱氨酶的作用下生成2-酮丁酸，2-酮丁酸在酪氨酸转氨酶的作用下，以L-天冬氨酸为氨基供体，生成产物L-2-氨基丁酸和副产物草酰乙酸。草酰乙酸自发脱羧生成丙酮酸，后者在乙酰乳酸合成酶的作用下生成乙酰乳酸，乙酰乳酸进一步自发脱羧生成3-羟基-2-丁酮，从而促使反应朝着产物生成方向进行。但该法L-2-氨基丁酸最大得率为54%，因为反应中生成的丙酮酸也可以作为氨基受体，导致副产物丙氨酸的形成。由于丙氨酸与产物L-2-氨基丁酸性质相似，增加了后续产物分离的难度。2001年，Ager等［17］在此基础上研究了提高L-2-氨基丁酸产物得率和产物分离纯化的方法。在底物浓度为500 mmol/L时，转化率达到58.3%，纯度大于92%。为了进一步消除副产物丙氨酸，Zhu等［18］在三酶催化基础上，在反应体系中耦联丙氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶，反应结束后，分离纯化产物，最终L-2-氨基丁酸的纯度大于99%。

Shin等［19］克隆表达来自Vibrio fluvialis JS17 的ω-转氨酶，以50mmol/L 2-酮丁酸和70mmol/ L苯甲胺为底物，采用两相反应体系不对称合成L-2-氨基丁酸，反应5 h，转化率达到96%，e.e.值大于99%，但反应中有机溶剂的存在会影响酶的稳定性。2012年Malik等［20］以外消旋苯乙胺为氨基供体，以L-苏氨酸为底物，在ω-转氨酶和苏氨酸脱氨酶的作用下，同时拆分苯乙胺生成手性胺和不对称合成L-2-氨基丁酸，2.5 h转化率达到94%，e.e.值大于99%。2013年Park等［21］以异丙胺为氨基供体，L-苏氨酸为底物（100 mmol/L），在来源于Ochrobactrum anthropic的ω-转氨酶和苏氨酸脱氨酶催化下，反应1 h，转化率达到99%，e.e.值大于99.9%。异丙胺是一种廉价的氨基供体，且转氨反应后形成的产物丙酮易挥发，促使反应朝着L-2-氨基丁酸合成方向进行，这种方法具有工业化潜力。

1.7氨基酸脱氢酶法

该法以2-酮丁酸为底物，在亮氨酸脱氢酶或缬氨酸脱氢酶的作用下不对称合成L-2-氨基丁酸。氨基酸脱氢酶以NADH为辅酶，所以在催化体系中需要耦合辅酶再生体系。该反应中的2-酮丁酸价格昂贵，一般也可以通过苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸脱氨获得，苏氨酸脱氨酶、亮氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶三酶催化合成L-2-氨基丁酸的途径如图8所示［22-25］。1997年Galkin等［26］利用来源于Thermoactinomyces intermedius的耐热的亮氨酸脱氢酶催化2-酮丁酸合成L-2-氨基丁酸，得率为88%，e.e.值大于99%，产物质量浓度达到36 g/L。2014年Tao等［27］利用来自Bacillus cereus的高比酶活亮氨酸脱氢酶，通过优化三酶催化条件，在30 L反应体系中底物浓度达到1 mol/L，产物得率97.3%，e.e.值大于99%。脱氢酶法具有较好的工业化开发前景，其瓶颈在于如何实现辅酶的高效再生，降低生产成本。

2　结论

生物法合成L-2-氨基丁酸具有反应条件温和、过程高效和立体选择性严格等优势，工业化应用前景广阔；发酵法体系复杂、分离纯化难度大；而酶催化工艺又面临酶活力低、稳定性差、重复使用率不高等问题。因此，后续L-2-氨基丁酸生物合成工艺开发应主要集中在以下两个方面：一方面要筛选改造获得高稳定性高催化活力的转氨酶、氨基酸脱氢酶等；另一方面优化催化工艺，如通过使用固定化酶增加反应批次，同时利于产物的分离纯化。

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（责任编辑：朱小惠）

Advance in the biosynthesis of L-2-am inobutyrate

PAN Gousheng，ZHENG Renchao，ZHENG Yuguo
（Institute of Bioengineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

Biosynthesis provides an eco-friendly approach for L-2-aminobutyrate due to its high stereoselectivity and mild condition.This review summarized the biosynthetic method of L-2-aminobutyrate such as microbial fermentation，biotransformations with aminoacylase，amino acid oxidase，amidase，nitrilase，transaminase and amino acid dehydrogenase.The advances and the limitations of thesemethodswere assayed.In order to reduce cost of industrial production of L-2-aminobutyrate，suggestions and countermeasureswere also put forward for the existing problems. Keywords:levetiracetam；L-2-aminobutyrate；microbial fermentation；biocatalysis

TQ463

A

1674-2214（2016）03-0182-06

2016-04-05

潘苟生（1991—），男，江西新余人，硕士，研究方向为生物催化，E-mail：pangoushengzjut@163.com.通信作者：郑裕国教授，E-mail：zhengyg@zjut.edu.cn.