AcMNPV bro基因的表达和作用研究

张　楠,葛　晶,周子谦,尹　隽,钟　江

(复旦大学 生命科学学院 微生物学与微生物工程系,上海 200438)



AcMNPVbro基因的表达和作用研究

张楠,葛晶,周子谦,尹隽,钟江

(复旦大学 生命科学学院 微生物学与微生物工程系,上海 200438)

bro基因(baculovirusrepeatedorf)是杆状病毒编码的一个独特的基因家族,一些病毒的基因组中编码有多个该基因家族的成员.研究分析了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)基因组仅有的一个bro基因，结果表明： AcMNPVbro基因(ac-bro)在感染后 6h 就开始转录,并在8h时检测到BRO表达；ac-bro基因敲除的重组病毒感染后子代病毒的效价略低于野生型病毒,且其DNA复制明显推迟.利用大肠杆菌中重组表达的Ac-BRO蛋白进行的体外实验提示其具有结合DNA的能力.这些结果提示ac-bro基因在病毒的复制中有一定的作用.

杆状病毒；bro基因家族； DNA结合； 基因敲除

杆状病毒是感染昆虫的大型双链 DNA病毒,其代表种苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifonicamultiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV)基因组约134kb,编码154个基因[1].bro(baculovirusrepeatedorf)是杆状病毒特有的一个基因家族[2],不少病毒都编码了多个bro基因,例如OpMNPV,BmNPV,LdNPV,XcGV分别编码了3个,5个,16个和7个bro[3-6].但也有些病毒中并不编码该基因家族的成员,如PxGV,AfMNPV和RoMNPV[7-9].

杆状病毒编码的BRO蛋白的大小从88个氨基酸到450个氨基酸不等,但它们N端的80～150个氨基酸(Bro-N)保守性较强,都带有核酸结合域[10-11].虽然该基因分布广泛,但其功能尚无明确结论.有研究提示该蛋白可能利用CRM1介导的核运输通道进行蛋白质的运输[12].也有研究表明,有些BRO蛋白可能在病毒感染抑制宿主mRNA转译方面有一定的作用[13].AcMNPV仅编码一个bro基因(orf2,这里称为ac-bro),目前对其功能所知甚少.本研究分析了ac-bro基因的表达和潜在的功能,提出其表达产生的BRO蛋白具有结合DNA的活性,在病毒复制中具有一定的作用.

1　材料与方法

1.1细胞和病毒

Spodopterafrugiperda细胞株Sf9用TMN-FH培养基(Sigma-Aldrich)添加10%胎牛血清和 100U/mL 青霉素、100μg/mL链霉素后培养.细胞转染用Cellfectin试剂(Invitrogen)进行.vAcGFP是一株表达绿色荧光蛋白(EGFP)的重组杆状病毒AcMNPV,系由多角体蛋白基因启动子表达egfp基因,利用Bac-to-Bac系统(Invitrogen)构建[14].ac-bro基因敲除的重组病毒vAcGFPΔBRO的构建见后.病毒效价用终点稀释法在96孔板中进行.

1.2Ac-BRO蛋白的原核表达

ac-bro的基因序列通过PCR扩增,引物为Ac-bro1-up和Ac-bro1-down(表1).PCR产物(651bp)回收后,用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,并克隆到pET-28a(+)(Novagen),保持ac-bro的读码框与载体上N-端6×His读码框一致,得到pET-Ac-bro,并经酶切和测序验证正确.用pET-Ac-bro转化的E.coliBL21 (DE3)进行Ac-BRO蛋白的表达.1L菌液在摇床中培养3h后,加入0.8mmol/L IPTG,在16℃下继续培养14h.菌体4000r/min离心,沉淀悬浮于适量20mmol/L Tris,pH 7.4,300mmol/L NaCl,10mmol/L咪唑(pH 7.4)中,用超声裂解菌体.重组Ac-BRO蛋白带有6×His标签,可以结合到Ni2+-NTA柱(Novagen)上,并通过梯度浓度的咪唑溶液洗脱纯化.Ac-BRO蛋白在250mmol/L时洗脱下来.蛋白溶液用Centripreps(Amicon,10kD)脱盐和浓缩.

表1　本研究所用PCR引物序列

1.3ac-bro基因在感染细胞中的转录

从AcGFP感染的Sf9细胞和对照Sf9细胞中提取中RNA,用TRIzol Max RNA Isolation Kit (Invitrogen) 进行,并用RevertAid M-MuLV transcriptase (Fermentas)进行cDNA的合成.用Ac-bro2-up和Ac-bro2-down(表1)进行PCR检测.

1.4抗体制备和Western blot

用纯化的Ac-BRO蛋白根据标准方法免疫小鼠,获得抗血清.免疫组化检测Ac-BRO蛋白时[15],用AcGFP感染Sf9细胞,不同时间后收集,进行SDS-PAGE(12%)和Western blot.分别用所制备的抗血清(1∶500稀释)和碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体(Sigma-Aldrich, 1∶30000稀释)作为第一和第二抗体检测Ac-BRO的表达.

1.5Ac-bro敲除的重组杆状病毒的构建

病毒基因组中ac-bro上下游的临近区域分别用P1/P2,以及P3/P4两对引物(表1)进行PCR扩增,产物先后克隆到pUC18载体,在上下游序列之间带有一个BamHⅠ位点.在该位点处插入阿普拉霉素(Apramycin)抗性基因片段,得到pBroFLK-Apra.该质粒通过PCR,酶切和DNA序列分析等方法验证正确.包括上下游以及抗性基因的片段用P1/P4引物进行PCR扩增,所得到的DNA片段用于电转化带有AcGFP基因组(BacGFP)的E.coliRecA+菌株BJ5183-BacGFP.电转化用BioRad电转仪进行,条件设为2.5kV,25μF及200Ω.用带有50μg/mL 卡那霉素,7μg/mL 庆大霉素和40μg/mL 阿普拉霉素的培养基筛选转化细菌,并从阳性克隆中提取Bacmid DNA,经PCR验证正确,命名为BacGFPΔBro.用该Bacmid DNA转染Sf9细胞,得到ac-bro敲除的重组病毒vAcGFPΔBro.

1.6病毒基因组DNA的Real-time PCR定量

Sf9细胞在24孔细胞培养板中培养,并以vAcGFP和AcGFPDBro感染(10pfu/cell).在感染后不同时间收集细胞,用PBS漂洗一次后, 悬浮于500μL 裂解缓冲液(10mmol/L pH 8.0 Tris,10mmol/L EDTA, 0.25% SDS),50℃ 处理1h.用酚氯仿法抽提细胞内总DNA,用DNA SYBR-Green 试剂盒(TOYOTB)进行病毒基因组DNA的Real-time PCR定量检测.所用引物为ORF2fw/ORF2rv(表1).

1.7Ac-BRO蛋白与DNA的结合

此实验中所有水均用Milli-Q水(Millipore).重组表达的Ac-BRO蛋白(350μmol/L)经2倍系列稀释后,与DNA片段共同在室温下孵育20min,孵育混合液(12μL)的组成为: 结合缓冲液(100mmol/L Tris,500mmol/L KCl,10 mmol/L DTT,pH 7.5),NP40,10mmol/L MgCl2,Ac-BRO或BSA和DNA(0.15pmol/L).所用DNA为一段24 nt的单链寡核苷酸(表1,EMSAoligo1).孵育后混合液用低离子强度的非变性聚丙烯酰胺凝胶(15%)进行电泳,电泳缓冲液为TBE (25 mmol/L Tris,20mmol/L硼酸，0.25mmol/L EDTA).电泳在200V,4℃下进行4h.随后,凝胶分别用10%乙醇和0.7%硝酸固定 10min和6min,再用0.2% AgNO3染色5min.用Milli-Q 水清洗一次(2min)后,用3.0% NaOH和0.1%甲醛显色约5min.

2　结　果

2.1ac-bro在感染细胞中的表达分析

RT-PCR结果表明,病毒感染后6h,ac-bro基因就开始转录,直到48h均可以检测到其mRNA(图1(a)),表明ac-bro基因在感染的早期就得到转录.用所制备的抗Ac-BRO抗血清进行感染细胞总蛋白的Western blot分析,结果表明感染后8h就能检测到Ac-BRO蛋白(图1(b)),随后蛋白水平有所上升,直到感染后期有所下降.

2.2ac-bro敲除病毒vAcGFPDBro的构建和分析

用同源重组的方法构建了ac-bro敲除的重组杆状病毒病毒vAcGFPΔBro(图2(a)).用PCR验证了重组病毒的正确性(图2(b)).用P1/P4引物进行PCR,AcGFP和野生型AcMNPV均得到2.1kb的产物,而vAcGFPΔBro得到了2.5kb的产物,与预期一致；用位于插入的阿普拉霉素抗性基因内部的引物P5与P1进行PCR,得到0.75kb的产物,也证明了vAcGFPΔBro中已经敲除了ac-bro(图2(b)).

分别用vAcGFP和vAcGFPΔBro感染Sf9细胞(5pfu/cell),测定感染后不同时间点培养液中病毒的效价,结果见图3.vAcGFPΔBro的病毒产量略低于vAcGFP.提取感染细胞的总DNA,用Real-time PCR检测了DNA复制的动态.从图4中可见,vAcGFPΔBro病毒DNA水平的上升较晚,但同样,到最后,vAcGFPΔBro与vAcGFP都达到了相似的DNA水平.

2.3Ac-BRO蛋白与DNA结合能力的分析

Ac-BRO蛋白的N端带有潜在的单链DNA结合域.用银染EMSA方法对其结合DNA的能力进行了分析.如图5所示,重组Ac-BRO蛋白系列稀释后,与一段24nt的寡核苷酸(表1,EMSAoligo1)孵育后,导致该寡核苷酸的电泳迁移率发生变化,而小牛血清白蛋白对寡核苷酸的电泳情况没有影响.

3　讨　论

bro基因是杆状病毒众多基因中非常独特的成员,不同的病毒有不同的拷贝数,从零到十几个不等.与bro序列相关的基因在一些痘病毒和噬菌体等中也有发现[10,16-17].在所有bro基因中,家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的bro基因研究最多,已经知道所有这5个bro基因都在感染的早期得到转录和翻译[2],而其中3个BRO蛋白,BRO-A,C,D,是核蛋白,具有核酸结合能力[18].研究提示这些BRO蛋白可能是利用CRM1介导的核输出通道的核-质转运蛋白[12],而BRO-A, C, D 3个BRO蛋白N端的富含亮氨酸的序列具有核输出信号的作用.BmNPV BRO-B和BRO-E蛋白可以和宿主BmTRN-1相互作用,抑制某些mRNA的转译[13].也有的BRO蛋白则能和层粘连蛋白相互作用[19],具体功能还不清楚.

ac-bro是AcMNPV编码的唯一的bro家族基因,共编码328a.a.其基因序列与BmNPVbro-d最接近.Ac-BRO其N端1～80为bro-N基序,此外在188～252区域还有1个未知功能的保守基序(DUF3627),在昆虫痘病毒、昆虫虹彩病毒及变形虫Mimivirus等中也有发现.本研究的结果提示,尽管ac-bro上游带有晚期启动子的特征序列(ATAAG),但事实上它在感染后很早就得到转录和转译,且持续较长时间,这与BmNPVbro基因,尤其是bro-d基因相似.而ac-bro与BmNPVbro-d的序列同源性也高达80.2%.本研究还显示,Ac-BRO蛋白具有结合单链寡核苷酸的能力.这种结合是非特异性的,因为用不同的寡核苷酸甚至双链DNA也得到类似的结果(结果未显示).敲除ac-bro对病毒的DNA复制有明显的影响,尽管对子代病毒产量的影响较小. 这些结果提示虽然ac-bro并非病毒复制所必须,但它在病毒的复制中仍然具有相当的作用,对病毒DNA合成的作用尤为明显.但其究竟是通过何种机制发挥这种作用的,则还有待进一步的研究揭示.

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Expression and Function of AcMNPV bro Gene

ZHANG Nan, GE Jing, ZHOU Ziqian, YIN Juan, ZHONG Jiang

(Department of Microbiology and Microbial Engineering, School of Life Sciences,FudanUniversity,Shanghai200438,China)

Unlike some baculoviruses that encode multiplebro(baculovirusrepeatedorfs) family genes, AcMNPV contains only onebrogene (ac-bro). Here, we show thatac-browas transcribed and translated in the early stage of virus infection. A mutant AcMNPV with deletion inac-browas generated and exhibited slightly decreased virus titer compared to wild type virus, while the viral DNA replication was significantly delayed. Ac-BRO was expressed inE.coliand the purified Ac-BRO can bind oligonucleotide. These results suggested that Ac-BRO played a role in AcMNPV replication in the cells.

baculovirus; bro; DNA binding; gene knockout

0427-7104(2016)01-0128-05

2015-04-24

国家自然科学基金(31170143)

张楠(1989—),硕士研究生；钟江,男,教授,通讯联系人,E-mail: jzhong@fudan.edu.cn.

Q 786

A