IL-24联合大蒜素体外抗肺癌细胞生长的实验研究

张逸平，李正祎

（1.吉林大学中日联谊医院，吉林长春　130013；2.吉林医药学院检验学院，吉林吉林　132013）

IL-24联合大蒜素体外抗肺癌细胞生长的实验研究

张逸平1，李正祎2

（1.吉林大学中日联谊医院，吉林长春130013；2.吉林医药学院检验学院，吉林吉林132013）

目的探讨抑癌基因IL-24联合大蒜素对肺癌A549细胞凋亡的影响，并初步探讨其作用机制.方法提取前期构建的pDC316-hIL-24-EGFP质粒，转染肺癌A549细胞，分为A组（空白对照组）、B组（单独大蒜素组（40 μL/mL））、C组（脂质体+IL-24组）、D组（大蒜素（40μL/mL）+脂质体+IL-24）.荧光显微镜下观察质粒的转染情况；流式细胞仪检测细胞凋亡；Western blot法检测pDC316-hIL-24-EGFP、大蒜素和联合用药作用A549细胞48 h 后IL-24，Bax，Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平.结果大蒜素（40μL/mL）和pDC316-h IL-24-EGFP单用48 h对A549细胞均有明显抑制作用；大蒜素（40μL/mL）联合pDC316-hIL-24-EGFP比单用pDC316-hIL-24-EGFP作用更强（P＜0.05）；大蒜素（40μL/mL）、pDC316-hIL-24-EGFP和两药联用48 h后，A549细胞凋亡率分别为32.7%，39.4%和68.8%；大蒜素（40μL/mL）和/或IL-24作用于A549细胞48 h后，Bax/Bcl-2的比值及Caspase-3表达均上调，联合用药组效果尤其明显.结论pDC316-hIL-24-EGFP联合大蒜素可协同抑制人肺癌A549细胞生长，机制可能是通过调节基因Bax/Bcl-2的表达比率，并上调Caspase-3的表达，进而诱导A549细胞的凋亡.

IL-24基因；大蒜素；联合用药；A549细胞；细胞凋亡

【引用格式】张逸平，李正祎.IL-24联合大蒜素体外抗肺癌细胞生长的实验研究［J］.北华大学学报（自然科学版），2016，17（3）: 335-338.

肺癌的发病率和死亡率很高，已被国家卫生部列为今后癌症防治的重点［1］.肺癌的病因至今尚不完全明确，长期大量吸烟可导致肺癌的发生，同时城市大气污染和烟尘中含有的致癌物质很有可能也与肺癌的发病有关，北京、上海和广州市大气污染指标对居民肺癌发病及死亡的影响以及导致肺癌的潜伏期已有研究报道［2］.

癌症是一种基因病，人体细胞在内外环境因素作用下，激活多种原癌基因的表达，和/或抑癌基因失活，经多阶段长期演变即可发生癌症.癌症的基因治疗是肺癌的主要治疗方向，采用基因治疗与其他药物联合，通过多途径发挥抗癌效应具有潜在的应用前景.为此，我们将对肿瘤细胞有特异性抑制作用的IL-24基因［3］转染人肺癌细胞，并联合天然的抗癌药物大蒜素［4］，研究两者协同作用对肺癌细胞A549产生的生长抑制作用.

1　材料和方法

1.1主要试剂与仪器

pDC316-hIL-24-EGFP为携带增强型绿色示踪蛋白并含有目的基因IL-24片断的穿梭质粒，由吉林医药学院李正祎博士提供；大蒜素（徐州莱恩药业有限公司，2 mL:30 mg）；人肺癌细胞株 A549（肺腺癌）为本室保存；RPMI 1640、胎牛血清培养基（GIBCO公司）；Lipofectamine 2000（Invitrogen公司）；质粒抽提和纯化试剂盒（美国Omega bio-Tek公司）；Annexin-V-PE和7-AAD双染细胞凋亡试剂盒（天津三剑公司）；流式细胞仪型号为Epics XL（美国贝克曼公司）；小鼠抗人 IL-24抗体（abcam公司）；一抗Caspase-3、Bax、Bcl-2、β-actin、山羊抗鼠IgG/辣根酶标记、二抗、山羊抗兔IgG/辣根酶标记（北京中杉金桥生物技术有限公司）.

1.2细胞转染、药物处理及联合用药时序贯方式

转染前24 h将人肺癌A549细胞分别以每孔1 ×105接种到6孔板上，培养液为含10%胎牛血清的1640培养基.待细胞生长 70%～80%时，按Invitrogen公司的Lipofectamine 2000试剂说明书进行操作，24 h后在荧光显微镜下观察细胞内EGFP表达情况，判断转染效率.未转染、未加药的细胞作为空白对照，其他分别以pDC316-hIL-24-EGFP单独转染，和/或大蒜素（40μL/mL）联合处理A549细胞.收集药物处理48 h的细胞，完成后续实验.联合组给药的序贯方式是采用质粒pDC316-hIL-24-EGFP转染A549细胞1 h后加大蒜素.

1.3细胞凋亡分析

分组同上（1.2），37℃、5%CO2培养24 h后收集细胞，PBS清洗2次.用1×binding buffer调节细胞至106～107个/mL，取其中100μL细胞于流式管中，加10μL PE标记的Annexin-V于冰上混匀，避光15min，再加1×binding buffer 380μL和10μL 7-AAD，进行FCM检测.

1.4蛋白质表达的检测

取对数期生长的A549肺癌细胞，以1×105/孔接种于六孔板中，培养24 h后换成无血清的1640培养液4 h后给药，分组同上，继续培养，24 h后根据细胞浓度加细胞裂解液进行蛋白的提取，然后进行超声处理，用BCA法对蛋白进行定量检测.按50 μg/孔标准上样，10%SDS-PAGE分离，通过电转移法将蛋白质转移至PVDF膜后，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h.加入一抗（1∶500鼠抗人HSP-70，兔抗人Bax，Bcl-2，Caspase-3，β-actin）4℃孵育过夜，TBST漂洗3次（5min/次）后，加入二抗（辣根过氧化物酶标记的1∶3 000羊抗鼠/兔IgG）室温孵育2 h，TBST充分漂洗3次（5min/次），化学发光试剂反应1 min，X线片暗室曝光，常规显影、定影.

1.5实验数据统计学分析

实验数据采用SPSS 15.0统计软件进行分析，两样本间均数比较采用t检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义.

2　结　果

2.1基因转染结果

根据携带绿色荧光蛋白基因质粒的特点，转染pDC316-hIL-24-EGFP的细胞既可以表达IL-24又可以表达EGFP蛋白.在荧光显微镜下可以观察到转染后24 h有50%～60%的A549细胞发出绿色荧光.见图1.

2.2FCM检测IL-24基因联合大蒜素对A549细胞凋亡的影响

药物作用48 h时，与空白对照组比较，IL-24组（39.4%，3.27%）、单独大蒜素（40μL/mL）组（32.7%，3.27%）及联合用药组（68.8%，3.27%）A549细胞均明显凋亡，其中尤以联合组诱导A549细胞凋亡的作用明显强于IL-24组和单独大蒜素（40μL/mL）组（P＜0.05）.见图2.

2.3W estern blot检测 A549细胞 IL-24，Bax，Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平

IL-24、大蒜素（4μL/mL）、联合用药组均在作用48 h后不同程度影响Bax，Bcl-2，Caspase-3的表达.其中大蒜素和/或IL-24均使Bax表达明显上调，联合组表达上调明显；Bcl-2表达下调，但IL-24组表达下调不明显；大蒜素和/或 IL-24均使Caspase-3明显上调，其中联合组表达上调明显.见图3.

3　讨　论

目前大多数国家的肺癌发病率和死亡率上升趋势明显，对人类的健康危害极大.肺癌早期缺乏典型症状及体征，因此，临床上确诊时往往已是晚期，此时传统的放化疗对肺癌的疗效有限.化疗是肺癌的主要治疗方法，约90%以上的肺癌患者需要接受化疗治疗.但在肿瘤化疗过程中，化疗药物也对正常增殖细胞产生杀伤作用.如何在药物使用过程中既对肿瘤细胞产生最大程度的杀伤而又尽可能降低将对正常细胞的毒性已越来越引起人们重视.

黑色素瘤分化相关基因（melanoma differentiation associated gene，mda-7）也称白介素24（interleukin 24，IL-24）是与IL-10同属一个细胞因子家族的成员，但功能上却有差异.IL-24是1995年Jiang H等［5］从β干扰素（Interferon-β，IFN-β）和蛋白激酶C激活剂MEZ诱导分化的人恶性黑色素瘤细胞H0-1细胞中克隆的新抑癌基因.IL-24蛋白为分泌性蛋白，除具有抑制多种肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等作用，同时具有“旁观者抗肿瘤特性”［6］，被誉为攻克肿瘤的“明星基因”之一［3］.未来IL-24基因药物或其高效生物蛋白制品很有希望被应用于特异性杀伤肿瘤的治疗当中.

大蒜素有人称其为“抗癌之王”，能杀伤肿瘤细胞，对正常细胞毒性较小，是一种天然抗癌药物［4］.国内外研究均发现:大蒜素具有抗肿瘤活性，能抑制多种肿瘤细胞的增殖，如肝癌［7］、结肠癌［8］、骨肉瘤［9］、卵巢癌［10］等.同时大蒜素还可激发免疫系统，释放多种活性因子，进而通过机体细胞免疫和体液免疫抑制肿瘤细胞生长，从而达到防癌和抗癌的功效.

肿瘤的形成和发展的原因之一是细胞增殖和凋亡失衡.本研究在前期成功构建携带IL-24基因真核表达载体的基础上，体外研究其诱导肺癌A549细胞凋亡效应及潜在的分子机制.通过FCM检测，我们发现脂质体介导的IL-24基因表达联合大蒜素能明显的抑制肺癌细胞生长，当两者联合应用于A549细胞48 h后，A549细胞的凋亡率高达68.8%，显著高于各单独药物使用组，差异具有统计学意义.通过本实验研究发现:IL-24联合大蒜素对肺癌细胞A549增殖具有比单独应用更强的抑制作用.IL-24与大蒜素在肺癌治疗上的互补性，既能提高抗肺癌的作用效果，又能降低各自使用剂量，从而达到减轻不良反应的目的.上述两种药物合用提高疗效的作用机制可能与IL-24与大蒜素诱导肿瘤细胞凋亡具有不同的作用机制、分子基础有关，特别是与IL-24可通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡有关.

大蒜素诱导肿瘤细胞凋亡途径中的成分得到了广泛关注.本实验Western blot结果显示:IL-24 和/或大蒜素作用A549细胞后，大蒜素组及联合组Bcl-2蛋白表达水平均下调，IL-24组Bcl-2蛋白表达无明显改变.而各组Bax蛋白表达水平均上调，提示IL-24和/或大蒜素可能是通过上调 Bax/ Bcl-2基因表达比率诱导肺癌A549细胞凋亡，联合组上调Bax/Bcl-2基因表达比率尤为明显.

Caspase家族在调控细胞凋亡过程中起关键作用，可使核酸内切酶活性增高、DNA断裂、细胞凋亡形成.Caspase家族中的caspase-9，caspase-3是凋亡过程中被激活的关键酶，也是细胞凋亡的主要执行因子及效应因子［11］.Oommen S等［12］发现大蒜素上调肿瘤细胞caspase-3，caspase-8，caspase-9蛋白表达明显，进而诱导癌细胞形成凋亡小体和核固缩.本研究发现:IL-24和/或大蒜素作用A549细胞后，各组caspase-3蛋白均明显上调，其中尤以联合组上调明显.

综上所述，IL-24和/或大蒜素对A549细胞有诱导凋亡作用，其诱导细胞凋亡可能与上调 Bax/ Bcl-2基因表达比率、增强caspase-3基因表达有关.但体内实验结果是否能与上述体外实验类似，还有待进一步研究.

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【责任编辑：陈丽华】

Experimental Study on Effects of IL-24 Combined with Allicin on the Growth of Human Lung Adenocarcinoma in Vitro

Zhang Yiping1，Li Zhengyi2
（1.China-Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun 130013，China；2.Inspection College of Jilin Medical College，Jilin 132013，China）

Objective To investigate the apoptosis effect of tumor suppressor gene IL-24 combined with allicin on A549 lung cancer cell lines，as well as to explore the molecular mechanisms. Method Pre-constructed recombinant plasmid pDC316-hIL-24-EGFP was extracted and then transfected to A549 cells.There were four test groups treated with different agents，including group A（ blank control） ，group B（ allicin（ 40 μL /mL） ） ，group C （ pDC316-hIL-24-EGFP and lipofectamine transfection ） ，group D （ pDC316-hIL-24-EGFP and lipofectamine transfection combined with allicin （ 40 μL /mL） ） . The transduction efficiency of target cells was detected by fluorescent microscope，and apoptosis was tested by flow cetometry.The expression levels of IL-24，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in A549 cells treated with pDC316-hIL-24-EGFP and allicin alone or in combination for 48 h were detected by Western blot.Results Both allcin （ 40 μL /mL） and pDC316-hIL-24-EGFP alone could inhibit the growth of A549 lung cancer cells，and the combined treatment resulted a synergistic effect （ P＜0.05） .After beingtreated with allcin （ 40 μL /mL） ，pDC316-hIL-24-EGFP and combination therapy for 48 h，the apoptosis rates of A549 cells was 32.7％，39.4％ and 68.8％，respectively.The rate of Bax /Bcl-2 and the expressions of Caspase-3 in the treatment groups all increased，and the combination groups exhibited the most obvious effect. Conclusion The combination of pDC316-hIL-24-EGFP and allcin has a synergistic inhibition on the growth of A549 cells，which apoptosis mechanism may be related to the increased ratio of Bax /Bcl-2 and the regulation of Caspase-3 protein expression.

IL-24 gene；allcin；combination drug therapy；human lung adenocarcinoma A549 cell；apoptosis

R737.9

A

1009-4822（2016）03-0335-04

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.03.011

2015-11-26

吉林省教育厅科学技术研究项目（2012494）.

张逸平（1989-），男，硕士，医师，主要从事肿瘤发病机制研究，E-mail:1239071466@qq.com；通信作者:李正祎（1975-），男，博士，副教授，主要从事肿瘤发病机制研究，E-mail:lzyzwy1234@aliyun.com.