俄罗斯蓝靛果忍冬优良无性系微繁技术

葛丽丽，张启昌，梁　天，陈　振

（北华大学林学院，吉林吉林　132013）

俄罗斯蓝靛果忍冬优良无性系微繁技术

葛丽丽，张启昌，梁天，陈振

（北华大学林学院，吉林吉林132013）

以俄罗斯引进的蓝靛果忍冬优良无性系Berel（L.caerulea var.kamtschatika X altaica）、Rus1（L.caerulea var. kam tschatika）和Rus2（L.caerulea var.regeliana X altaica）为研究对象，以其健壮枝条上的茎尖及茎段为外植体，进行组织培养研究，建立适合俄罗斯蓝靛果忍冬外植体生长、扩繁、生根的基本培养程序.结果表明:俄罗斯蓝靛果忍冬的3个优良无性系以MS+1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA为初代培养基效果均较好，但继代增殖培养基和生根培养基差异较大.其中，适合Berel增殖的培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA，增殖系数达到5.6，生根培养基为WPM+1.5mg/L IBA；适合Rus1和Rus2继代增殖的培养基为WPM+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA，增殖系数达到6.8和7.6，生根培养基为1/2MS+0.2mg/L IBA；适合俄罗斯蓝靛果忍冬试管苗移栽的基质为草炭土+河沙（体积比1∶1）的混合基质.

蓝靛果忍冬；组织培养；无性系

【引用格式】葛丽丽，张启昌，梁天，等.俄罗斯蓝靛果忍冬优良无性系微繁技术［J］.北华大学学报（自然科学版），2016，17（3）: 315-321.

蓝靛果忍冬（L.caerulea L.）果实为小浆果，是忍冬科忍冬属的一种灌木，简称蓝靛果，富含维生素、有机酸、糖类、矿物质及多种微量元素，味美，可鲜食，同时亦可加工成果汁、果酱、果酒等［1-4］.具有清热解毒、改善肝脏解毒功能、抗肿瘤、抗疲劳、稳定血压、促进身体发育等功效，具有较高的药用、食用、医疗保健和观赏价值，备受美国、俄罗斯、日本等国家的青睐，是新兴的绿色果树资源，发展前景广阔［1-2］.近年来，已研究证明了蓝靛果的抗氧化、抗疲劳作用，及其对高脂血症、肝损伤的治疗以及对肿瘤的抑制作用［5］.20世纪80年代开始，我国就已经开展了野生蓝靛果忍冬的驯化栽培试验和开发利用研究，新品种选育及定量化培育的试验工作也渐趋成熟，已通过对国内蓝靛果忍冬（L.caerulea var.edulis）不定芽的诱导及壮苗生根培养基的不断筛选，筛选出最佳初代、继代、壮苗和生根培养基，为生产实践提供了一套适合蓝靛果忍冬大规模生产的，高效、稳定的快速繁殖技术［6-8］.然而，对于俄罗斯蓝靛果忍冬的组织培养还未见系统报道［9-10］.本研究旨在通过对从俄罗斯引进的优良无性系Berel（L.caerulea var.kamtschatika X altaica）、Rus1 （L.caerulea var.kamtschatika）和Rus2（L.caerulea var.regeliana X altaica）进行微繁技术研究，优选出适合俄罗斯蓝靛果忍冬的增殖和生根培养基，为缩减蓝靛果忍冬组培苗培育时间及优质苗的工厂化生产和种质资源的保存提供科学依据.

1　材料与方法

1.1试验材料

所用的外植体材料分别是从俄罗斯引进的蓝靛果忍冬Berel，Rus1和Rus2共3个无性系.

1.2试验方法

1.2.1外植体处理

选取俄罗斯蓝靛果忍冬生长期生长旺盛的当年生未木质化枝条，放在自来水下冲洗2 h，去除表面污垢后在超净工作台上采用0.1%的氯化汞溶液灭菌6min［1，11］，再用无菌水冲洗3～5次，之后剪取长约2 cm的带芽茎段，将表面的水分晾干，然后接种在已经灭菌的初代培养基中.

1.2.2外植体培养

培养选择MS培养基为基本培养基，附加1.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA［1］，pH为5.8，121℃灭菌15m in；当分化出芽后转接到增殖培养基中，观察生长状况.增殖培养基选择参考文献［1，7，9］等所提供的培养基类型，在此基础上做相应调整，选出适合俄罗斯蓝靛果忍冬增殖的培养基；生根培养基选择MS，1/2MS，1/4MS，WPM，附加不同浓度的NAA及IBA，生根培养30 d后，观察其生根情况；炼苗时，首先在自然光下闭瓶炼苗7 d，然后将瓶盖打开炼苗2～3 d后将已生根小苗移栽到事先灭菌的河沙、草炭土、草炭土+河沙（1∶1）的3种基质中，30 d后统计试管苗的成活率.

1.2.3培养条件

培养温度（26±2）℃，光照强度1 500～2 000 lx，光照时间14 h/d，空气湿度在60%左右.

1.2.4数据处理

以30瓶为试验的一个处理，重复3次，污染率在接种的7 d后统计，在接种的30 d后统计增殖率、增殖系数、生根率、生根条数、生根长度.数据采用SPSS 20.0统计软件进行方差分析和差异显著性检验.

2　结果与分析

2.1初代培养与不定芽萌发

将已经过处理的外植体剪成1～2 cm的茎段，每个茎段1～2个腋芽，接种到初代培养基上观察，一周后统计其污染率，30 d后统计诱导情况、茎伸长情况及试管苗的粗壮程度.3种俄罗斯蓝靛果优良无性系初代培养的情况见表1，3种优良无性系初代苗见图1.

表1　3种俄罗斯蓝靛果优良无性系初代培养情况Tab.1　Prelim inary culture situation of three excellent clones of L.caerulea

2.2增殖培养

2.2.1Berel增殖培养基筛选

将蓝靛果外植体经初代培养后所形成的腋芽和不定芽剪切后接种在增殖培养基上继代培养，接种30 d后统计不同处理增殖生长的效果，结果见表2.由表2可看出:各处理间增殖系数差异显著.当基本培养基为1/2MS（培养基4，5，6号）时，试管苗增殖系数都较高，但试管苗生长细弱，节间距短，基部多愈伤组织，影响试管苗生长，所以培养基4，5，6号不适合做增殖培养基使用；选择基本培养基为MS（培养基1，2，3号）培养基时，试管苗生长良好.比较1，2，3号培养基可以发现3号培养基增殖系数高，达到5.6倍，因此选择3号培养基（MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA）作为Berel的增殖培养基.Berel增殖苗见图2.

2.2.2Rus1，Rus2增殖培养基筛选

不同培养基Rus1，Rus2增殖生长效果见表3.由表3可知:Rus1和Rus2在增殖培养过程中，无性系之间并没有显著差异.Rus1和Rus2均在7号培养基上增殖系数达到最高，Rus1达到6.8倍，Rus2达到7.6倍；Rus1和Rus2在处理4，5，6中丛生芽均较多，但试管苗细弱，基部愈伤组织多，且节间距短.1，2，3号培养基试管苗生长差，8，9号培养基虽然试管苗生长健壮，但增殖系数较低，达不到组织培养的效果.对比发现，适合Rus1和Rus2增殖的培养基均为7号培养基（WPM+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA）.Rus1增殖苗见图3，Rus2增殖苗见图4.

表3　不同培养基Rus1，Rus2增殖生长效果Tab.3　Effect of proliferation for Rus1 and Rus2 on differentmediums

2.3生根培养

2.3.1Berel的生根培养

将继代的蓝靛果试管苗剪切成带有3～4个腋芽的植株分别转接到不同的生根培养基中.WPM作为基本培养基，添加不同浓度的生长素IBA及NAA，观察其生根效果，10 d后陆续开始产生根原基，待30 d后，都能产生一定数量的根系.由表4可知:生长素NAA和IBA 对Berel试管苗生根都有一定的促进作用，在生根率和根数量方面，处理1，2，3与处理4，5之间有显著差异，处理1最好，生根率可达到93%；在根长方面，处理1与处理3之间没有差异，根都比较长.综合考虑，生长素IBA生根效果比NAA好.由于根数和根长会直接影响试管苗移栽成活率，因此，选择WPM+1.5mg/L IBA培养基为Berel的生根培养基，生根率高、根数量多，有利于试管苗移栽的成活率.Berel生根苗见图5.

表4　不同浓度植物生长素对Berel生根的影响Tab.4　Effects of plant grow th regulators on Berel rooting

2.3.2Rus1，Rus2的生根培养

1）Rus1，Rus2生根基本培养基的选择.基本培养基选择MS，1/2MS，1/4MS，WPM 4种培养基，附加1.5 mg/L的IBA，对比生根效果，结果见表5.表5表明:不同基本培养基对Rus1，Rus2生根的影响显著，1/2MS生根率最高，Rus1为53%，Rus2为56%，生根条数及根长都优于其他3种基本培养基.因此，选择1/2MS培养基作为Rus1和Rus2生根的基本培养基.

表5　不同基本培养基对Rus1和Rus2生根的影响Tab.5　Effects of different basic m edium on rooting of Rus1 and Rus2

2）不同生长素浓度对Rus1，Rus2生根的影响.以1/2MS培养基为基本培养基，加入不同浓度的生长素IBA，对比生根效果，选择适合Rus1，Rus2生根的浓度，试验结果见表6.由表6可知:高浓度生长素（1.5 mg/L和1.0mg/L）的生根率都比较低，随着IBA浓度的降低，生根效果变好，但当浓度为0时，不生根.综合根的生长情况，适合Rus1，Rus2生根的生长素IBA浓度为0.2mg/L.

综上所述，适合Rus1，Rus2生根的培养基组合为1/2 MS+0.2 mg/L IBA，生根率可达85%以上.Rus1生根苗见图6，Rus2生根苗见图7.

表6　不同生长素浓度对Rus1和Rus2生根的影响Tab.6　Effects of different regulator concentrations on rooting of Rus1and Rus2

2.4炼苗及移栽

为使试管苗适应外界环境条件，炼苗是试管苗进行移栽前的关键一步，经过炼苗后的试管苗，可以大大提高成活率.炼苗时，首先在自然光下闭瓶炼苗7 d左右，之后打开瓶盖炼苗2～3 d，即可将试管苗移栽到装好基质的营养钵中.注意试管苗不能在强光直射下炼苗，尤其是在中午光照过强时，要进行适当遮阴处理.

炼苗结束后就可移栽，移栽基质选择草炭土、河沙和草炭土+河沙（1∶1）3种基质，移栽30 d后统计其成活率及试管苗生长状况，试验结果见表7.由表7可知:3种基质试管苗成活率都较高，均可达到80%以上，草炭土+河沙的混合基质成活率最高，可达到98%，并且试管苗生长健壮，速度快，因此是适合俄罗斯蓝靛果忍冬试管苗移栽的基质.移栽后7 d内，要保证空气湿度在85%以上，可在移栽之后的试管苗上面覆盖一层塑料薄膜以确保湿度，否则，试管苗会因失水而死亡；温度也不能过高或过低，最好控制在28℃左右.待试管苗长出新芽后，慢慢降低湿度，使其慢慢适应外界环境.移栽成活的部分苗见图8.

3　结论与讨论

蓝靛果忍冬属于一种小浆果，其果实里含有丰富的营养物质，但只靠在自然条件下进行繁殖，效率太低，而采用绿枝扦插又受插穗来源限制，并且繁殖系数也较低.组织培养微繁技术扩展了传统的营养繁殖技术，具有较高的繁殖效率、较大的繁殖系数等优点，适宜优良品种大量扩繁.本课题组曾对蓝靛果忍冬芽体组织培养进行了初步研究，筛选出最佳消毒方案、最佳基本培养基与最佳外植体［6］，对国内蓝靛果忍冬的继代增殖、生根、炼苗及移栽也有初步研究［1］.目前，对国内蓝靛果忍冬的组织培养报道较多，但对从俄罗斯引进的蓝靛果的组织培养研究还比较少，因此，建立俄罗斯引进的蓝靛果忍冬的离体快繁体系具有重要意义.

对于植物的离体培养，由于其遗传特性、生物学特性和生态学特性不一致，对营养的需求也不尽相同，因此筛选适宜培养基对植物组织培养尤为重要.不同的蓝靛果忍冬无性系组织培养体系并不相同，在适合国内蓝靛果忍冬生长的培养基上培养从俄罗斯引进的蓝靛果忍冬时发现，其并不适合俄罗斯蓝靛果忍冬生长，出现了黄化、死亡、增殖系数低等现象.

对于激素在培养基中的应用，已有大量的试验证明了Skoog等［12］提出的“激素平衡”理论的正确性，生长素和细胞分裂素等激素对植物的生长发育和芽的诱导均起着重要作用.因此，培养基中激素的种类与浓度配比对蓝靛果的诱导和增殖影响极其显著，是蓝靛果忍冬组培快繁技术的核心.

本次研究建立了3个俄罗斯蓝靛果忍冬优良无性系的离体快繁体系.根据“激素平衡”理论，试验中将6-BA与IBA配合使用，不同配比浓度对蓝靛果继代培养丛生芽数的增加效果不同.由试验可知:Berel增殖适合培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA，增殖系数达到5.6倍，Rus1，Rus2增殖适合培养基为WPM+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA，增殖系数分别达到6.8倍和7.6倍；不同基本培养基及激素浓度配比对蓝靛果不定根的诱导产生也不同，Berel生根适合培养基为WPM+1.5 mg/L IBA，生根率达到93%，Rus1，Rus2生根适合培养基为1/2MS+0.2mg/L IBA，生根率在85%以上；根据不同基质试验，适合俄罗斯蓝靛果忍冬移栽的基质为草炭土+河沙（1∶1）的混合基质，炼苗移栽的成活率可达到98%.

［1］张启昌.蓝靛果忍冬生态适应性及高效繁育体系的研究［D］.北京:北京林业大学，2009.

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【责任编辑：郭伟】

Micropropagation of Excellent Clones of Russian Lonicera caerulea

Ge Lili，Zhang Qichang，Liang Tian，Chen Zhen
（Forestry College of Beihua University，Jilin 132013，China）

L.caerulea excellent clone（L.caerulea var.kamtschatika X altaica），Rus1（L.caerulea var.kamtschatika）and Rus2（L.caerulea var.regeliana X altaica）introduced from Russia as the research objects，with its strong branches on the stem tip and stem segments as explants for tissue culture，a completemicro-propagation protocol is developed for Russia L.caerulea.The results showed that the 3 excellent clones of Russian L.caerulea with MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA as primary radical had better effect，but subculture proliferation medium and rooting medium were large differences，which is suitable for training base of the proliferation of Berel MS+2.0mg/L 6-BA+ 0.2mg/L IBA，the proliferation coefficient reached 5.6，rooting culture medium for WPM+1.5 mg/L IBA and training base for Rus1 and Rus2 proliferation WPM+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA.The proliferation coefficient reached 6.8 and 7.6，and rooting medium for 1/2MS+0.2 mg/L IBA，Russia L.caerulea test tube seedling transplantingmatrix ismixed matrix of turfy soil+sand（rate of volume 1∶1）.

Lonicera edulis；tissue culture；clones

S793.9

A

1009-4822（2016）03-0315-07

10.11713/j.issn.1009-4822.2016.03.007

2016-02-06

吉林省科技发展计划项目（20120269；20140307025NY）；中央财政林业科技推广示范项目（2013TJQ04）；大学生创新项目（201410201076）.

葛丽丽（1978-），女，博士研究生，实验师，主要从事森林培育研究，E-mail:gelili_062@163.com；通信作者:张启昌（1964-），男，博士，教授，主要从事森林培育研究，E-mail:zqc1212@sina.com.