PAF-AH在过敏性紫癜和紫癜性肾炎中的变化及意义

张琦，童文娟，孙建新，康国贵

PAF-AH在过敏性紫癜和紫癜性肾炎中的变化及意义

张琦，童文娟，孙建新，康国贵

目的探讨血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）血浆活性、基因突变在过敏性紫癜（HSP）和紫癜性肾炎（HSPN）中的变化及意义。方法101例过敏性紫癜患儿分为紫癜性肾炎组（HSPN组）和非紫癜性肾炎组（N-HSPN组），80例健康儿童作为对照组。应用酶水解底物法检测患儿血浆PAF-AH活性；聚合酶链反应（PCR）、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）法检测患儿血浆型PAF-AH基因第9号外显子-994位点的基因型，并用直接计数法计算基因突变频率和等位基因频率，根据PAF-AH基因位点突变与否，将HSP患儿分为突变组和未突变组。结果HSP患儿血浆PAF-AH活性明显低于健康对照儿童（＜0.05），HSPN组患儿血浆PAF-AH活性明显低于N-HSPN组（＜0.05）；过敏性紫癜组与健康对照组PAF-AH基因-994位点的突变率分别为4.95%、1.25%，T等位基因频率分别为2.48%、0.62%，差异无统计学意义（＞0.05），而HSPN组与N-HSPN组患儿基因突变率分别为12.50%、0，T等位基因频率分别为6.25%、0，差异均有统计学意义（均＜0.05）；基因突变组患儿镜下血尿、蛋白尿的发生率高于未突变的患儿（均＜0.05），基因突变组患儿mAlb、TRF异常率高于未突变患儿（均＜0.05），而 1-MG、IgG的异常率两组无显著差异（均＞0.05）。结论HSP患儿血浆PAF-AH活性降低可能参与了HSP、HSPN的发病过程；其第9外显子-994位点的基因突变可能参与了过敏性紫癜肾损害的发生。

紫癜，过敏性；肾炎，紫癜性；血小板活化因子乙酰水解酶；活性；基因突变

过敏性紫癜（HSP）是儿童常见的系统性小血管炎，常累及肾脏，导致紫癜性肾炎（HSPN），直接影响HSP的预后。HSPN的发病由多因素导致，而肾内外的炎性细胞因子可能在肾组织的免疫性损伤中发挥重要作用［1-2］。研究证实，血小板活化因子乙酰水解酶（PAF-AH）参与了过敏性紫癜的发病过程，并且PAFAH的血浆浓度与肾脏损害程度密切相关［3］，但作为一种水解酶，其活性变化能否影响疾病的表现，目前还不明确。本研究对过敏性紫癜患儿PAF-AH第9号外显子-994位点基因型进行检测，探讨其血浆活性以及基因突变在疾病中的变化及意义。现将结果报道如下。

1　资料与方法

1.1研究对象收集2011年3月至

2012年3月在宁波市妇女儿童医院住院的HSP患儿101例，治疗并随访6个月。其中40例患儿存在肾脏损害（HSPN组），61例无肾脏损害（N-HSPN组）。HSPN组男22例，女18例；平均年龄（7.8±2.1）岁。N-HSPN组男33例，女28例；平均年龄（7.2±2.3）岁。所有患儿均为初发病例，符合HSP及HSPN诊断标准［4］。同期本院体检的健康儿童80例作为健康对照组，其中男49例，女31例；平均年龄（7.6±2.0）岁。排除标准：排除原发性肾小球疾病、血小板减少性紫癜、系统性红斑狼疮、乙型肝炎及川崎病等。所有研究病例，均未使用糖皮质激素及免疫抑制剂。

1.2方法

1.2.1标本采集和处理健康对照组及HSP患儿入院时，以EDTA-K2抗凝管抽取外周静脉血2 ml，以1500 r/min，离心5 min，分离出上清液置于离心管中，—20℃冰箱中保存，待测血浆PAF-AH活性。在沉积于抗凝管底部的细胞沉淀物中加入PBS缓冲液，至2 ml，盖好后上下颠倒混匀。准备10 ml小试管，加入2.5 ml淋巴细胞分离液，再用吸管将细胞沉淀的混合液小心加入淋巴细胞分离液，使细胞沉淀处于上层。再1700 r/ min离心10 min，可见分层现象，用吸管小心吸取外周血单个核细胞至清洁塑料小试管中，再加PBS液至5ml，用吸管混匀。再次置于离心机中，1700 r/min离心5 min后，迅速倒掉上清液，最终得到用于提取DNA的细胞沉淀，—20℃保存。

1.2.2血浆PAF-AH活性测定采用美国Cayman公司提供的血浆PAF-AH活性检测试剂盒，设定空白孔2孔，加10 l DTNB和15l化验用缓冲液。阳性对照孔2孔，加入10l DTNB，10l人血浆PAF-AH标准品和5l化验用缓冲液。样品孔每样本3孔，加10 l DTNB，10 l血浆样品和5 l化验缓冲液。（加到孔里的PAF-AH的量应导致这样的结果，即每分钟增加的吸光度值在0.01～0.1，必要时将样品进行稀释或浓缩。）每孔加入200 l底物溶液（2-thioPAF），开始反应，记录开始反应的准确时间，尽可能快得加完底物溶液。均匀震摇反应板30 s，使其混匀。在酶标仪上以405 nm波长为测量波长，每隔1分钟读取吸光度值，至少读取5个时间点。至少在1.2个吸光度单位内，反应是线性的。测定各样本吸光度变化率，根据说明书中公式计算PAF-AH活性。

1.2.3PAF-AH基因型的测定

1.2.3.1利用血液基因组DNA提取试剂盒，从每个样本的细胞沉淀中提取DNA100 l，置于离心管中，—20℃保存。

1.2.3.2引物合成参照文献［5］方法，由上海Invitrogen公司合成：上游引物A：5’-CTATAAATTTATATCATGCTT-3’，下游引物B：5’-TTTACTATTCTCTTGCTTTAC-3’；C：5’-TCACTAAGAGTCTGA ATAAC-3’，D：5’-TCACTAAGAGTCTGAATAAA-3’。引物A和B参与扩增PAF-AH第9号外显子，引物A和C扩增正常等位基因，引物A和D扩增突变等位基因。

1.2.3.3聚合酶链反应将每个样本DNA分别用3对引物进行扩增，25 l P CR反应体系包括：PCR试剂盒中Premix Taq（含TaqDNA聚合酶1.25 U/25 l。d NTP Mixture 2×conc；各0.4 mmol/L。PCR Buffer 2×conc，3 mmol/L Mg2+）12.5 l，10mol/L引物2条（A+B，A+C，A+ D）各 0.5l，样本基因组 DNA 2.5 l，RNase-FreeH2O9 l。在DNA扩增仪上，设定以下程序进行扩增：预变性94℃1 min；变性94℃1 min，退火56℃l min，延伸72℃1min，共5个循环；变性94℃30s，退火52℃30 s，延伸72℃30 s，共25个循环；最后再延伸72℃5 min。

1.2.3.4DNA扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳将灭菌蒸馏水12.3 ml、40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 7.5 ml、5× Tris硼酸5 ml、10%过硫酸铵183l、TEMED16.6 l依次加入烧杯，混合均匀后迅速加入制胶槽中，插入梳齿，等待4 h左右，12%聚丙烯酰胺凝胶形成。将制胶槽放入电泳槽，加入内槽液（1×tris硼酸）200 ml，拔出梳齿，在形成的小孔中进行加样：第1孔中加5 lDNAMarker，第2、3、4孔中依次加入第1号样本的3份扩增产物（PCR中参与的引物分别为A+B、A+C、A+D）5 l+1 l上样缓冲液，第5、6、7孔中加入第2号样本的3份扩增产物和上样缓冲液。再加入外槽液约50 ml，连接电泳仪，设置电压200 V，电泳50min左右，待电泳条带到达距离凝胶底部1 cm左右，关闭电泳仪。

1.2.3.5DNA核酸银染将凝胶取下，采用超快核酸银染试剂盒进行染色、漂洗、显色、再漂洗，置于凝胶成像仪中，观察凝胶上的条带并拍照，分析结果。引物A和B参与扩增的160bp片断，是整个PAF-AH基因第9号外显子；引物A和C参与扩增的108 bp片断，是PAFAH基因第9号外显子正常序列（-994位点处为G）；引物A和D参与扩增的108 bp片断，是PAF-AH基因第9号外显子的突变序列（-994位点处为T）。

1.3尿常规及尿微量蛋白的检测

1.3.1尿常规检测包括镜下血尿、蛋白尿等。

1.3.2尿微量蛋白检测采用免疫浊度分析仪IMMAGE800，根据速率散射比浊法原理测定，检测尿 1-微球蛋白（ 1-MG）、免疫球蛋白G（IgG）、微量白蛋白（mAlb）、转铁蛋白（TRF），正常范围分别是＜12.5mg/L、＜8.5mg/L、＜19.0mg/L和＜2.0mg/L，高于正常范围视为异常。

1.4统计方法采用SPSS17.0统计软件进行分析，计量资料数据用均数±标准差表示，采用检验；计数资料采用Fisher确切概率法。＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1不同组别血浆 PAF-AH活性比较HSP组血浆 PAF-AH活性明显低于健康对照组（=2.12，＜0.05），HSPN组血浆PAF-AH活性明显低于N-HSPN组（=3.10，＜0.05），见表1。

2.2基因扩增产物的电泳结果分析及基因型判断PAF-AH基因-994位点第9号外显子的完整扩增片段为160 bp，正常等位基因和突变等位基因扩增片段均为108bp。每个样本均以第9号外显子的完整扩增片段为阳性对照（A+B），如图1中的第2、5泳道；若只扩增出正常等位基因（A+C），即为正常基因型（GG型）；若同时有正常等位基因（A+C）和突变等位基因（A+D），即为突变杂合子型（GT型）；若仅扩增出突变等位基因（A+D），即为突变纯合子型（TT型），但本研究中未发现。GT、TT型均为突变型。

2.3不同组别基因突变率及等位基因频率的比较101例HSP患儿中，血浆型 PAF-AH基因第9外显子-994位点为GG型者96例，GT型者5例（均为HSPN患儿），TT型0例。健康对照组80例中，GG型79例，GT型1例，TT型0例，两组基因突变率分别为 4.95%、1.25%。计算出T等位基因频率［T=（2× TT+GT）/（2×n）］，HSP患儿为2.48%，健康对照组为0.62%，两组差异无统计学意义（=0.23），见表2；但HSPN组与NHSPN组基因突变率分别为12.50%、0，T等位基因频率分别为6.25%、0，差异均有统计学意义（=0.008、0.01），见表3。

2.4不同基因型组之间临床表现、尿常规及尿微量蛋白的比较根据是否存在基因突变，将101例HSP患儿分为突变组（ =5）和未突变组（=96）。101例患儿均有皮肤紫癜表现，突变组与未突变组发生率均为100%。基因突变组患儿镜下血尿、蛋白尿的发生率高于未突变的患儿（=0.02、0.00），见表4。基因突变组患儿尿mAlb、TRF的异常率高于未突变患儿（=0.00、0.02），而尿 1-MG、IgG的异常率两组差异均无统计学意义（均＞0.05），见表5。

3　讨论

在生物体内，PAF以动态形式存在。Archer等［6］对健康志愿者用不同浓度的PAF皮下注射后，进行连续的皮肤组织病理检查，发现低浓度的PAF可诱导血管内中性粒细胞聚集，血管周围多种炎性细胞浸润；而较高浓度的PAF可直接损伤血管，出现严重的内皮细胞肿胀，血管周围单核细胞、中性粒细胞浸润，有时可见白细胞碎裂。根据PAF-AH在人体的存在形式，分为血浆型和细胞型。细胞型的PAF-AH编码尚未被克隆，血浆型的PAF-AH基因位于6p12-21，有12个外显子。近年发现，血浆型PAF-AH具有基因多态性，存在着多个点突变类型，在东亚人已报道第9外显子994（G→T）和1001（A→G）突变［7-8］，可使PAF-AH活性降低或缺乏。1型糖尿病患者血浆PAF-AH活性明显低于健康对照组［9］，支气管哮喘患者也是明显降低的［10］。新生儿严重感染时血浆PAF水平增高，PAF-AH活性降低，且两者变化趋势与预后相关［11］。本研究检测出HSP患儿血浆PAF-AH活性明显低于健康对照儿童，笔者认为该酶活性降低可能参与了HSP的发病过程；紫癜性肾炎患儿血浆PAFAH活性明显低于非紫癜性肾炎患儿，提示该酶活性降低也参与了HSPN的发病。陆彪等［3］发现，HSPN组患儿PAFAH mRNA及蛋白表达水平均较 NHSPN组及健康对照组增高。笔者考虑可能正是由于血浆型PAF-AH活性下降，不足以水解PAF以抑制其导致的病理损伤作用，机体的自身调节使得PAFAH反应性地表达增加，以发挥其可能存在的保护作用。

表1　不同组别血浆PAF-AH活性比较

图1　血浆型PAF-AH基因第9外显子-994位点基因型检测电泳图

表2　HSP组与健康对照组血浆型PAF-AH基因第9外显子-994位点基因突变频率及等位基因频率的比较　例（%）

表3　HSPN组与N-HSPN组血浆型PAF-AH基因第9外显子-994位点基因突变率的比较　例（%）

表4　不同基因型组之间主要临床表现发生情况的比较　例

表5　不同基因型组之间尿微量蛋白异常发生情况的比较　例（%）

关于PAF-AH基因突变与HSP、HSPN之间的关系，张慧玉等［12］研究发现PAF-AH基因突变与HSP的发病无关，但HSPN患儿PAF-AH基因突变发生率达52.9%，与普通人群比较差异有统计学意义，提示 PAF-AH基因突变与HSPN的发病有关。本研究也发现，HSP患儿的基因突变率与健康对照组患儿相比差异无统计学意义，而HSPN患儿的该基因突变率明显高于N-HSPN组，与以上研究结果基本一致。

关于PAF-AH与HSP临床表现的相关性目前研究不多。本研究结果显示，基因突变的HSP患儿出现肾脏受累的概率更大，尤以镜下血尿和蛋白尿为著，故推测PAF-AH基因第9外显子-994位点发生突变可能与HSP的肾脏损害有关。但由于样本例数偏少，可能存在统计误差，需要收集大样本资料进行反复验证。尿微量蛋白在一定程度上也能够早期反映肾脏滤过、重吸收功能的变化，笔者研究发现，基因突变的患儿尿微量白蛋白、尿转铁蛋白的异常率明显高于未发生基因突变的患儿，两组 1-MG、IgG的异常率差异无统计学意义。这两个发现表明该基因突变可能与HSPN的发病密切相关，这与HSPN的肾脏病理改变主要在肾小球这一特点是相符合的。

综上所述，HSP患儿血浆PAF-AH活性降低可能参与了HSP、HSPN的发病过程，其第9外显子-994位点的基因突变可能参与了HSP肾损害的发生。本研究的不足之处在于，所有病例中未发现纯合子突变基因型（TT），可能与样本例数不足有关。PAF-AH基因第9外显子-994位点（G→T）突变率的大小，目前报道尚不一致，还需要多中心、大规模样本进行研究检测。

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10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.046

R725.4

A

1671-0800（2016）07-0931-04

315010宁波，宁波市妇女儿童医院（张琦、孙建新、康国贵）；安徽省儿童医院（童文娟）

康国贵，kanggui2006@aliyun.com

2016-05-09（本文编辑：姜晓庆）