Not c h1在肌成纤维细胞转化中的作用及表达变化*

于秀文，曾林祥

（1.浙江省杭州市萧山区第一人民医院 呼吸科，浙江 杭州 311200；2.南昌大学第二附属医院 呼吸科，江西 南昌 330006）

论著

Not c h1在肌成纤维细胞转化中的作用及表达变化*

于秀文1，曾林祥2

（1.浙江省杭州市萧山区第一人民医院 呼吸科，浙江 杭州 311200；2.南昌大学第二附属医院 呼吸科，江西 南昌 330006）

目的探讨在成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中，N ot c h1表达的变化规律，以及γ-分泌酶抑制剂（DA P T）抑制N ot c h信号后，对细胞转化的影响。方法取新出生2～3 d SD大鼠的肺组织，用胰酶消化法分离肺成纤维细胞，再将培养至第3代的细胞分为3组：对照组、转化生长因子-β1（T G F-β1）组、T G F-β1+ DA P T组。对照组为空白对照，T G F-β1组加入5ng/m l T G F-β1，T G F-β1+DA P T组同时加入5 ng/m l T G F-β1及5μm ol/L DA P T。采用免疫细胞化学法对α-平滑肌肌动蛋白（α-S M A）的表达变化进行检测。同时通过逆转录聚合酶链反应（R T-P C R）及W e s t e r n blot检测N ot c h1 mR NA和蛋白的表达变化。结果α-S M A免疫细胞化学结果表明，对照组大部分细胞无染色，而T G F-β1组则可见大部分细胞内有黄色和棕黄色颗粒及条纹，DA P T组和对照组无明显差异。对照组、T G F-β1组、T G F-β1+DA P T组N ot c h1 mR NA表达量分别为（0.278±0.022）、（0.783±0.018）和（0.313±0.029），对照组与T G F-β1组、T G F-β1组与T G F-β1+DA P T组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），对照组与T G F-β1+DA P T组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。对照组、T G F-β1组、T G F-β1+DA P T组N ot c h1蛋白表达量分别为（0.312±0.019）、（0.701±0.026）和（0.345±0.022），组间比较结果同N ot c h1 mR NA。结论N ot c h1可以促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，进而促进肺纤维化。

N ot c h1；α-平滑肌肌动蛋白；肌成纤维细胞；肺纤维化

Notch信号通路是一个调节细胞分化的经典信号通路，1917年首次在果蝇体内发现，在多种动物中都有其同源分子的存在，脊椎动物细胞主要是对于4 种Notch受体及5种Notch配体有相应的表达［1］。Notch信号通路生物学作用的发挥需要经过3步酶切作用，以及多种信号分子的联锁反应，而γ-分泌酶复合体的酶切作用则是其中最关键的环节，用γ-分泌酶抑制剂｛N-［N-（3，5-di f l u orophenacetyl）-L-alanyl］-（S）-phenyl g lycinet-b u tylester，D A P T｝能够对于γ-分泌酶复合体进行抑制，也就阻断Notch信号通路。

Notch信号通路在多种组织器官的发育和动态平衡中发挥重要作用，可以通过控制呼吸系统中多种细胞的功能和分化的方式，来调节肺的发育和维持成人体内呼吸道细胞种类的平衡［2］，同时在慢性肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、肺动脉高压、哮喘和肺癌中发挥重要作用［3］。近年来，有关Notch信号通路在肺损伤及肺纤维化中的作用机制亦是研究的热点，但仍然不甚明确。本研究旨在探讨成纤维细胞转化为肌成纤维细胞过程中，Notch1的作用及表达变化，为临床治疗肺纤维化提供理论依据。

1　材料与方法

1.1实验试剂

兔抗山羊Notch1多克隆二抗（美国S anta cr uz公司），山羊抗鼠Notch1多克隆一抗（美国S anta cr uz公司），免疫组织化学法试剂（北京中衫金桥生物技术有限公司），鼠α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth m u scle actin，α-S M A）单克隆抗体（武汉博士德公司），鼠β-肌动蛋白多克隆抗体、蛋白抽提试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，B C A）法蛋白定量试剂盒（美国P ierce公司），彩色预染蛋白质分子量标准（上海碧云天生物技术研究所），DN A M ar k er（北京天根生物科学技术有限公司），逆转录聚合酶链反应（re v erse transcription-polymerase chain reaction，R T-PC R）试剂盒（大连宝生生物工程有限公司），转化生长因子-β1（trans f ormin g g ro w th f actor-β1，T G F-β1）（美国P eproTech公司），D A P T（美国S i g ma公司），总R N A提取试剂。

1.2细胞分组

试验动物为江西中医学院动物房所提供的出生2～3 d的S D大鼠乳鼠（批号：J Z D W N O：2011-0093）。取其肺组织培养为肺成纤维细胞，具体培养方法参照文献并加以改进［4］。取第3代成纤维细胞，接种于6孔板，细胞密度达到85%～90%时，无血清同步24h。把细胞分为对照组、T G F-β1组和T G F-β1+D A P T组。其中，对照组为空白对照，在T G F-β1组中，T G F-β1的量为5 n g/ml，T G F-β1+D A P T组先加入终浓度为5μmol/l的D A P T，30min后再加入终浓度为5 n g/ml的T G F-β1，每组复孔3个，观察24 h后，分别用于提取细胞总R N A及总蛋白。实验重复3次。

1.3α-SM A免疫细胞化学实验

将18mm×18mm盖玻片置于6孔板内，同时在六孔板中进行第3代成纤维细胞的接种，其密度为每孔约1×105个细胞，按上述方法将细胞分为3组，每组复孔3个，观察24 h后取出盖玻片，4%多聚甲醛固定细胞，再用3%双氧水H2O2处理细胞10 min，封闭内源性过氧化物酶活性，磷酸盐缓冲溶液（phosphate b uff er saline，P B S）冲洗3次，10%动物血清封闭10min，降低非特异性结合，一抗4℃过夜，P B S冲洗3次，室温下孵育二抗1 h，链霉亲和素-生物素复合物（strept a v idin-biotin comple x，S A B C）复合物室温下30min，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，中性树胶封片后，光镜下观察各组染色变化，α-S M A阳性标准以出现棕黄色颗粒或条纹为依据，随机观察10个高倍视野，计算阳性率。

1.4RT-PCR反应检测Not c h1 m RN A

通过胰酶消化法实现对于六孔板内细胞的提取，Tri z ol法提取细胞总R N A并逆转录成cDN A。Notch1引物由美国I n v itro g en生命技术公司设计并合成，正向引物为：5'-G AA GG AA CG A GCC T GGG T GC C T G T A-3'，反向引物为：5'-T GGC T GGG A GC A T C T C AA GCC T-3'，扩增引物268 bp。反应条件：95℃预变性5 min，94℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸1min，共30次循环，总时间8min。在进行电泳时，取6μl PC R产物进行琼脂糖电泳，对于结果通过凝胶成像分析系统的紫外分光成像进行相应分析，对于积分吸光度进行记录。

1.5Wester n blot检测Not c h1蛋白

使用单去污细胞裂解液提取6孔板内细胞总蛋白，沸水煮10min使蛋白变性，冷却至室温后，置入-20℃冰箱冷冻保存备用。B C A法进行蛋白定量，取变性后的蛋白质样品行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodi u m dodecyl s u l f ate-polyacrylamide g elelectrophoresis，S D S-P A G E）电泳，每个泳道上样量为30μg，用垂直电泳仪进行电泳后取下凝胶，将蛋白转移至0.45mm醋酸纤维膜上，依次进行封闭、洗膜，加一抗在4℃孵育过夜（稀释至1∶200），二抗室温孵育2 h（稀释至1∶5 000）。通过化学发光法进行显影，将Notch1和β-肌动蛋白的灰度值进行相应的标准化后，计算Notch1蛋白表达的相对半定量比值。

1.6统计学方法

采用S P SS 18.0统计软件进行数据分析，计量分析用均数±标准差（x±s）表示，多个样本均数比较用单因素方差分析，组间比较用LS D-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1α-SM A免疫细胞化学

在对照组中，染色的细胞只占一小部分，能够看到少部分细胞中有淡黄色的颗粒或者是条纹，但是黄色以及棕黄色的颗粒和条纹却是极少的。但是T G F-β1组出现黄色以及棕黄色颗粒及条纹的细胞占据大多数。对照组、T G F-β1组、T G F-β1+D A P T组的α-S M A免疫细胞化学阳性率分别为（0.314± 0.019）%、（0.704±0.022）%和（0.339±0.026）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=10.172，P=0.072）。T G F-β1组与对照组和T G F-β1+D A P T组比较，经LS D-t检验，差异有统计学意义（t=23.176和18.354，P=0.023和0.034），T G F-β1组较对照组和T G F-β1+ D A P T组的α-S M A表达增加。T G F-β1+D A P T组与对照组比较，经LS D-t检验，差异无统计学意义（t= 2.573，P=0.112）。见图1。

图1　α-SM A细胞免疫化学电镜图 （×30）

2.2Not c h1 m RN A的表达

在对于R T-PC R产物进行电泳时，在268和207bp处，Notch1与β-肌动蛋白有着一定的表达条带。对照组、T G F-β1+D A P T组、T G F-β1组的 Notch1 m R N A表达量分别为（0.278±0.022）、（0.313±0.029）和（0.783±0.018），差异有统计学意义，T G F-β1组Notch1 m R N A表达量升高，而对照组与D A P T组比较差异无统计学意义。见附表和图2。

2.3Not c h1蛋白的表达

Notch1蛋白在120 k D处表达，在对照组（0.312±0.019）仅有少量Notch1表达。T G F-β1+D A P T组（0.345±0.022）与对照组的Notch1蛋白表达比较，差异无统计学意义。T G F-β1组（0.701±0.026）较对照组及T G F-β1+D A P T组中Notch1表达升高，差异有统计学意义。见附表和图3。

图2　RT-PCR反应检测各组细胞中Not c h1 m RN A表达的变化

附表　Not c h1 m RN A积分吸光度值比较 （n=3

附表　Not c h1 m RN A积分吸光度值比较 （n=3

组别蛋白对照组　0 . 2 7 8 ± 0 . 0 2 2 　0 . 3 1 2 ± 0 . 0 1 9 T G F -β1组　0 . 7 8 3 ± 0 . 0 1 8 　0 . 7 0 1 ± 0 . 0 2 6 T G F -β1+ D A P T组　0 . 3 1 3 ± 0 . 0 2 9 　0 . 3 4 5 ± 0 . 0 2 2 F值　1 2 . 8 2 9 　9 . 7 5 4 P值　0 . 0 6 9 　0 . 0 8 0 t1值　2 7 . 6 7 0 　2 1 . 3 4 4 P1值　0 . 0 1 5 　0 . 0 2 8 t2值　1 . 8 1 3 　1 . 9 1 7 P2值　0 . 2 0 2 　0 . 1 8 7 t3值　2 5 . 7 4 3 　1 9 . 5 1 2 P3值　0 . 0 1 7 　0 . 0 3 0 m R N A

图3　Wester n blot检测各组细胞中Not c h1蛋白表达的变化

3　讨论

肺纤维化是多种肺部疾病的共同结局，其主要病理特征是细胞外基质的沉积，以及肺泡结构的破坏，如肺泡囊肿的形成。而细胞外基质的主要成分是Ⅰ型胶原蛋白。研究表明，肌成纤维细胞是产生Ⅰ型胶原蛋白的主要细胞，也是肺纤维化的责任细胞［5］，而对于肌成纤维细胞来说，其表型的标志就是α-平滑肌肌动蛋白。而T G F-β1主要的作用是能够促进肺内成纤维细胞的转化，将其转化为肌成纤维细胞［6］，这在本研究中亦得到证实。α-S M A免疫细胞化学结果显示，T G F-β1组可见大部分细胞内有黄色和棕黄色颗粒及条纹，α-S M A表达较对照组明显增加，电镜下细胞内亦可见大量微丝束，提示T G F-β1可以促使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞。

Notch信号通路与肺纤维化的发生、发展密切相关［7］，其通过多种途径干预肺纤维化的病理生理过程，同时可以直接促进Ⅰ型胶原蛋白的表达。在肺纤维化患者的肺组织中，可见明显呈蜂巢样改变的肺泡囊肿，同时可以检测到Notch信号的过度表达。肺损伤后的结局是自我修复，还是发展为肺纤维化，可能部分取决于谱系阴性上皮干/祖细胞中的Notch信号通路［8］。P A U L等［9］证实活性氧簇（reacti v e o x y g en species，R O S）通过转录因子Nr f2依赖的方式激活Notch信号通路，从而促进气道基底干细胞的自我更新，启动清除细胞内活性氧的抗氧化程序。而这种氧化还原机制对肺内干细胞的生物学功能具有重要意义，比如肺损伤、肺纤维化、肺癌等。HU等［10］利用基因敲除及报告基因等方法证实在小鼠L929细胞及人胚肺成纤维细胞（H u man l u n g f ibroblasts，M R C-5）中，Notch信号通过H es1依赖方式调控成纤维细胞表达C ol1α1及C ol1α2，从而上调Ⅰ型胶原蛋白的表达，促进肺纤维化。

Notch信号通路可以促进肌成纤维细胞的表达。A OY A GI-I K ED A等［11］用免疫组织化学法证实，不管是在博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型中，还是在特发性肺纤维化的患者肺组织样本中，Notch信号在肌成纤维细胞中的表达都明显增强。研究还表明，Notch通过T G F-β-S mad3的途径激活在肺泡上皮细胞中辐射敏感启动子（radiation sensiti v e promoter，C ar G）依赖性和 T淋巴细胞抗原表位（Tlymphocyteepitope，T C E）依赖性的平滑肌肌动蛋白基因转录，以此来诱导肌成纤维细胞的分化［11］。本研究结果提示，在T G F-β1诱导生成的肌成纤维细胞中，Notch1表达较对照组明显增加，差异有统计学意义，说明Notch1与肌成纤维细胞的生成相关。同时当D A P T抑制Notch1后，肌成纤维细胞表型标志α-S M A表达明显降低，提示抑制Notch1可以抑制肌成纤维细胞的生成。进而笔者推测，T G F-β1可能通过活化Notch信号促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，阻断Notch信号可以抑制这种转化，即抑制肺纤维化的形成。

综上所述，T G F-β1可以促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，在肌成纤维细胞中，Notch1表达升高，D A P T阻断Notch后，可以抑制肌成纤维细胞的生成，其表型标志物α-S M A明显降低。由此可见，Notch信号通路在肌成纤维细胞生成以及肺纤维化中发挥着重要作用，阻断Notch信号可能成为治疗肺纤维化的新靶点。

［1］T H I B A U T Q，JU L I E D，S TE P H A N I E C，et al.I n f lammation dysre g u lates Notch si g nalin g in endothelial cells:I mplicationo f Notch2 and Notch4 to endothelial dys fu nction［J］.B iochemical P harmacolo g y，2010，80:2032-2041.

［2］Z H A N G S，L O C H A J，R A DT K E F，et al.J a gg edl is the ma j or re g u lator o f Notch-dependent cell f ate in pro x imal air w ays［J］.De v Dyn，2013，242（6）:678-686.

［3］X U K，M O G H A L N，E G A N S E.Notch si g nalin g in l u n g de v elopment and disease［J］.A d v E x p M ed B iol，2012，727:89-98.

［4］于秀文，曾林祥.Notch信号通路对肌成纤维细胞转化中α-S M A表达变化的影响［J］.中国现代医学杂志，2013，23（13）:11-14.

［5］E M B L O M-C A LL A H A N M C，C HH I N A M K，S H L OB I N O A，et al.G enomic phenotype o f non-c u lt u red p u lmonary f ibroblasts in idiopathic p u lmonary f ibrosis［J］.G enomics，2010，96:134-145.

［6］C O NTE E，F R U CI A N O M，F A G O NE E，et al.Nhibition o f PI3K pre v ents the proli f eration and di ff erentiation o f h u man l u n g f ibroblasts into myo f ibroblasts:the role o f class I P110 iso f orms［J］. P L o S O ne，2011，6:1-10.

［7］K A V I A N N，S E R V ETT A Z A，M O N G A R ET C，et al.Tar g etin g A D A M-17/Notch si g nalin g abro g ates the de v elopment o f systemic sclerosis ina m u rine model［J］.A rthritis R he u m，2010，62: 3477-3487.

［8］V A U G H A N A E，B R U M W E LL A N，X I Y L，et al.L inea g e-ne gati v e pro g enitors mobili z e to re g enerate l u n g epitheli u m a f ter maj or in j u ry［J］.Nat u re，2015，517（7536）:621-625.

［9］P A U L M K，B I S H T B，D A R M A W A N D O，et al.Dynamic chan g es in intracell u lar R O S le v els re g u late air w ay basal stem cell homeostasis thro u g h Nr f2-dependent Notch si g nalin g［J］.C ell S tem C ell，2014，15（2）:199-214.

［10］HU M，OUY A N G H F，WU CG，et al.Notch si g nalin g re g ulates col1α1 and col1α2 e x pression in air w ay f ibroblasts［J］. E x p B iol M ed，2014，239（12）:1589-1596.

［11］A OY A GI-I K ED A K，M A EN O T，M A T S U I H，et al.Notch ind u ces myo f ibroblast di ff erentiation o f al v eolar epithelial cells v ia trans f ormin g g ro w th f actor-β-S mad3 path w ay［J］.A m J R espir C ell M ol B iol，2011，45（1）:136-144.

（童颖丹 编辑）

Function and expressive change of Notch1 during transformation of m yofibroblasts*

Xiu-wen Yu1，Lin-xiang Zeng2
（1.Department of Respiratory Diseases，the First People's Hospital of Xiaoshan，Hangzhou，Zhejiang 311200，China；2.Department of Respiratory Diseases，the Second Affiliated Hospital，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330006，China）

Objective To study the law of changes of Notch1 expression in the transformative procession from fibroblasts to myofibroblasts and the effect of DAPT inhibition of Notch signal on cell transformation. M ethods The lung tissue was taken from new-born 2 or 3 day Sprague-Dawley rats.Fibroblasts were separated with pancreatin digestion method.The third-generation cultivated cells were divided into three groups: comparison group，TGF-β1group and TGF-β1+DAPT group.The comparison group was labeled as the control group，the TGF-β1group was added with 5 ng/m l TGF-β1，and the TGF-β1+DAPT group was added with 5 ng/m l TGF-β1and 5μmol/L DAPT.Immunocytochemistry was used to assess change ofα-smooth muscle actin（α-SMA）expression.RT-PCR was used to assess change of Notch1 mRNA expression.Western blot was used to assess change of Notch1 protein expression.Statistical software SPSS 18.0 was used for the dataanalysis with t-test.Resultsα-SMA immunocytochemistry demonstrated the majority of cells in the control group were not stained，the majority of cells in the TGF-β1group had yellow and brown-yellow granules and stripes，and there was no obvious difference between the DAPT group and the control group.The Notch1 mRNA expressive value of the control group，the TGF-β1group and the TGF-β1+DAPT group was（0.278± 0.022），（0.783±0.018）and（0.313±0.029）respectively；the Notch1 protein expressive value of the control group，the TGF-β1group and the TGF-β1+DAPT group was（0.312±0.019），（0.701±0.026）and（0.345± 0.022）respectively；there were significant differences in the mRNA and protein levels of Notch1 between the TGF-β1group and both the control and the TGF-β1+DAPT groups（P＜0.05），while the control group and the TGF-β1+DAPT group had no statistical differences（P＞0.05）.Conclusions Notch1 can promote transformation of fibroblasts into myofibroblasts，and then promote pulmonary fibrosis.

Notch1；α-smooth muscle actin；myofibroblast；lung fibrosis

R 363

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.15.011

1005-8982（2016）15-0060-05

2015-09-16

江西省自然科学基金（No：20132B A B205014）

曾林祥，E-mail：z en g lin x ian g@soh u.com；Tel：13037209570