二甲双胍对子宫内膜癌细胞凋亡影响相关性研究

卓志红，于慧敏

二甲双胍对子宫内膜癌细胞凋亡影响相关性研究

卓志红，于慧敏

目的探讨二甲双胍对子宫内膜癌细胞的细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响。方法选取Ishikawa细胞研究对象，以MTT法分析二甲双胍对肿瘤细胞的增殖抑制作用；采用流式细胞仪研究细胞周期；利用Annexin-V标记研究早期和晚期细胞凋亡。结果二甲双胍抑制细胞增殖，并可诱导细胞凋亡，其中早期、晚期病死率均较对照组升高；同时，细胞被阻滞于G0/G1期。结论二甲双胍可能通过阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡，抑制子宫内膜癌细胞的增殖。

子宫内膜癌；二甲双胍；细胞凋亡；细胞周期

子宫内膜癌是起源于子宫内膜上皮的恶性肿瘤。目前子宫内膜不典型增生及子宫内膜癌保守治疗的主要方法为孕激素的大量、长期应用。但部分子宫内膜癌的保守治疗存在着30%左右的失败率［1］。近年的研究提示，降血糖药物二甲双胍可能具有抑制肿瘤生长的作用，流行病学研究发现服用二甲双胍的糖尿病患者的肿瘤患病率显著低于未服用二甲双胍的糖尿病患者，并且癌症死亡的风险也显著降低［2］。研究发现，二甲双胍对前列腺癌、乳腺癌、肺癌以及胰腺癌具备抑制肿瘤的作用［3-4］。本研究通过二甲双胍干预Ishikawa细胞，观察其对细胞生长抑制情况，初步探讨二甲双胍对子宫内膜癌的细胞周期和凋亡的影响。现将结果报道如下。

1　资料与方法

1.1材料人子宫内膜癌 Ishikawa细胞株购自上海中科院细胞库。细胞培养用胎牛血清、双抗及RPMI 1640培养基购自Gibco公司。二甲双胍、MTT购自美国Sigma公司。DMSO购自Amresco公司。Annexin V-FITC流式细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。倒置显微镜为日本OLYMPUS公司；流式细胞仪为美国Becton Dickinson公司产品；透射电子显微镜为Philips公司TECNAL-10；图像分析系统为美国Labworks Analysis Softwar公司。

1.2细胞培养和MTT法细胞抑制率测定人子宫内膜癌Ishikawa细胞常规培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100 ng/ml链霉素的RPMI 1640培养基中，培养条件为37℃，5%CO2的湿润无菌环境。设对照组、二甲双胍1 mmol/L组、2.5mmol/L组、5mmol/L、10 mmol/L 和15 mmol/L组，处理24 h。收集对数生长期Ishikawa细胞，1×105/孔接种于96孔板。计数调整细胞浓度至 1×105/ml，设4复孔。检测波长490 nm，根据酶联免疫检测仪测定吸光度（A）值计算细胞存活率，细胞存活率=［1—（试验孔A490—调零孔A490）/（对照孔A490—调零孔A490）］×100%。根据MTT结果得出二甲双胍作用细胞的最佳浓度作为后续实验浓度。

1.3流式细胞仪检测细胞周期细胞接种于24孔培养板，每组设3复孔。二甲双胍作用24 h、48 h和72 h，予加入70%乙醇中，4℃固定12 h，离心；加入PBS重悬细胞，再次离心；加入碘化丙啶染色液，避光温浴30 min；用流式细胞仪在激发波长488 nm波长处检测红色荧光，同时检测散射情况；采用分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

1.4Annexin-V检测细胞凋亡细胞接种于24孔培养板，每组设3复孔。二甲双胍作用48 h，收集各组细胞，PBS洗涤后，离心沉淀，加入Annexin V-FITC结合液重悬细胞，加入 Annexin VFITC，室温避光孵育10 min，离心后加入Annexin V-FITC结合液、Propidium Iodide染色液重悬细胞，冰浴避光15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.5统计方法应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差表示，采用方差分析。＜0.05为差异统计学意义。

2　结果

2.1细胞生长抑制率MTT结果显示，当二甲双胍浓度为1mmol/L、2.5mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L和15 mmol/LIshikawa分别作用于肿瘤细胞24 h后，均明显抑制，且呈上升趋势（图1），提示二甲双胍可以抑制子宫内膜癌细胞的生长，同时二甲双胍作用的最佳浓度为10mmol/L，故选择该浓度作为后续实验的浓度。

2.2细胞周期v随着干预时间的延长，G0/G1期细胞总体呈上升趋势，而G2/M期细胞比例总体呈下降趋势，说明二甲双胍干预Ishikawa细胞后，阻滞细胞周期于G0/G1期，从而在G0/G1期阻断细胞增殖。见表1。

2.3细胞凋亡对照组和10 mmol/L浓度的二甲双胍处理细胞组，细胞的总凋亡率 分别为（8.03±0.22）% 和（80.59±0.71）%；实验组细胞调亡率显著高于对照组（图2）。

图1　二甲双胍干预子宫内膜癌细胞

表1　二甲双胍干预子宫内膜癌24 h、48 h、72 h的细胞周期表

图2　二甲双胍10 mmo/L作用子宫内膜癌48 h的Annexin-V凋

3　讨论

近来在乳腺癌、肾癌及结肠癌等肿瘤的研究中发现，二甲双胍可以杀伤对常规化疗药物耐药的肿瘤干细胞，抑制肿瘤干细胞的产生。二甲双胍对细胞具有强烈并且持续的抗癌作用，然而二甲双胍是否对子宫内膜癌具有抗癌作用仍不十分明确，因此对于该作用的进一步研究具有一定的临床潜在意义。而体外研究二甲双胍对肿瘤细胞生物学行为的影响有助于进一步明确二甲双胍抗癌的作用机制。通过此次研究，笔者发现二甲双胍能抑制子宫内膜癌Ishikawa细胞在体外的生长活性，具有显著的抑制作用，并呈现剂量-效果的依赖性关系。

细胞周期是细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束的全过程，分为细胞间期和分裂期，细胞间期又可分为G1期、S期和G2期。细胞增殖周期失控是恶性肿瘤呈现无穷增殖的重要原因。细胞是否顺利进入分裂周期及分裂周期能否成功地完成，主要取决于能否顺利通过2个重要关卡，即G0/G1期和G2/M期。细胞周期正调及负调因子表达紊乱与子宫内膜癌的发生、发展密切相关。国外研究表明，二甲双胍乳腺癌细胞生长中发现二甲双胍对肿瘤细胞增殖的抑制作用主要表现阻滞细胞周期于G1期［5］，而本研究发现，二甲双胍干预Ishikawa细胞后，导致细胞周期发生G0/ G1期阻滞，在G0/G1期阻断细胞增殖。这说明二甲双胍对内膜癌细胞的增殖抑制作用可通过阻滞 G0/G1期。细胞周期的运行主要由细胞周期依赖性激酶主导，细胞周期依赖性激酶需与细胞周期蛋白结合才能变成有活性，才能使细胞周期中G1-S和G2-M的转变。CyclinDl在细胞从G0/Gl期进入S期的过程中发挥关键作用，决定细胞是否继续生长和增殖。今后将着重研究二甲双胍阻滞肿瘤细胞周期的具体分子机制。

细胞凋亡是一种程序性死亡过程，本实验研究二甲双胍作用于Ishikawa细胞48 h后凋亡率的变化，发现经二甲双胍10 mmol/L干预48 h后凋亡情况，结果显示二甲双胍处理组较阴性对照组中细胞早期、晚期及总凋亡率高。有关的凋亡途径有细胞外途径和细胞内途径，在不同的凋亡途径中，Caspase的激活是一个“瀑式”级联反应过程，很多其他文献报道二甲双胍可以诱导乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌及黑色素瘤等肿瘤细胞发生调亡［6］，但Alimova等［5］却发现二甲双胍不会导致乳腺癌细胞凋亡，其中原因尚不知。本研究结果表明，二甲双胍能诱导子宫内膜癌Ishikawa细胞的凋亡，影响细胞生长周期并发生G0/G1期阻滞，明显抑制内膜癌细胞的增殖，提示二甲双胍有可能应用于子宫内膜癌的辅助治疗，但目前人体对于高浓度药物是否具备安全性尚需大量的临床实验数据。

［1］ Kaku T，Yoshikawa H，Tsuda H，et al. Conservative therapy for adenocarcinoma and atypical endometrial hyperplasia of theendometriuminyonngwomen：central pathologicreview and treatment outcome［J］. Cancer Lett，2001，167（1）：39-48.

［2］Decensi A，Puntoni M，Goodwin P，et al. Metformin and cancer risk in diabetic patients：a systematic review and metaanalysis［J］.Cancer Prev Res（Phila）2010 （3）：1451-1461.

［3］BenSahraI，LeMarchand-BrustelY，Tanti JF，et al.Metformin in cancer therapy：a new perspective for an old antidiabetic drug［J］？MolCancerTher，2010，9：1092-1099. ［4］Pollak M.Metformin and other biguanides in oncology：advancing the research agenda［J］.Cancer Prev Res（Phila），2010， 3：1060-1065.

［5］Alimova IN，Liu B，Fan Z.et al.Metformin inhibits breast cancer cell growth，colony formation and induces cell cycle arrestinvitro［J］.CellCycle，2009，8（6）：909-915. ［6］Yasmeen A，Beauchamp MC，Piura E，et al.Induction of apoptosis by metformin in epithelial ovarian cancer；involvement of the Bcl-2 family proteins［J］.Gynecol Oncol，2011，121（3）：492-498.

10.3969/j.issn.1671-0800.2016.07.041

R737.33

A

1671-0800（2016）07-0921-03

宁波市自然科学基金（2014A610234，2015A610226）

315010宁波，宁波市第二医院

卓志红，Email：zhuozhihong1@163.com

2015-10-23（本文编辑：姜晓庆）