白藜芦醇对鲍曼不动杆菌生物膜的抑制作用研究*

殷网虎　曹美林　李　佳　邓　慧（江苏省镇江市中医院，江苏 镇江 212003）



·思路与方法·

白藜芦醇对鲍曼不动杆菌生物膜的抑制作用研究*

殷网虎曹美林李佳邓慧
（江苏省镇江市中医院，江苏 镇江 212003）

目的 研究白藜芦醇对鲍曼不动杆菌生物膜的影响，为控制临床感染提供实验依据。方法 利用96孔聚苯乙烯板条构建生物膜的技术筛选生物膜形成菌株，并采用微量稀释法测定最小抑菌浓度（MIC）。结果白藜芦醇对鲍曼不动杆菌的MIC50为78.13 μg/mL，MIC90为312.5 μg/mL，SMIC50为312.5 μg/mL，SMIC90为625.0 μg/mL。结论 白藜芦醇体外对鲍曼不动杆菌生物膜具有明显抑制和破坏作用。

鲍曼不动杆菌白藜芦醇生物膜抑制

【Abstract】Objective：To investigate the effect of Resveratrol on biofilm of Acinetobacter Bauman to provide experimental basis for the control of clinical infection.Methods：Biofilm was selected with biofilm construction tech of 96 hole polystyrene slab to form strains，and Microdilution method was used to detect Minimal inhibitory concentration（MIC）.Results：MIC50 and MIC90 of resveratrol on Acinetobacter Bauman was 78.13 μg/mL and 312.5 μg/mL，respectively；SMIC50 and SMIC90 was 312.5 μg/mL and 625.0ug/ml，respectively.Conclusion：Resveratrol has obvious inhibition and destruction on biofilm of Acinetobacter Bauman.

【Key words】Acinetobacter Bauman；Resveratrol；Biofilm；Inhibit

白藜芦醇是非黄酮类多酚化合物，1940年由日本学者从毛叶藜芦的根部分离得到［1］。植物种子如葡萄、花生等含较丰富的白藜芦醇，研究表明白藜芦醇具有良好的抑菌活性［2］。美国疾病控制与预防中心曾估计，65%的人类感染都与细菌生物膜有关［3］。目前，鲍曼不动杆菌已成为医院内感染的重要病原菌，其生物膜（Biofilrn）作为主要毒力因子，参与鲍曼不动杆菌的粘附、耐药、应对环境变化、免疫逃逸等多个过程［4］。本研究主要探讨中药有效成分白藜芦醇体外对鲍曼不动杆菌生物膜的抑制作用，旨在为中药治疗由鲍曼不动杆菌生物膜引起的感染提供实验指导依据。现报告如下。

1　材料和方法

1.1菌株来源鲍曼不动杆菌菌株67株，均为二代菌，分离自笔者所在医院及镇江市其他医疗单位临床标本，各菌株均经DL-96细菌鉴定仪鉴定；大肠埃希氏菌ATCC259223标准菌株（二代菌）购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.2试剂仪器M-H（Muller-Hinton）药敏琼脂培养基和M-H肉汤干粉培养基，由杭州天和微生物试剂有限公司提供，批号130809。白藜芦醇（纯度大于≥99.5%），由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供，批号K1414052。96孔板由江苏康健医疗用品有限公司提供，批号20131012。DL-96自动微生物鉴定仪及鉴定卡由珠海市迪尔生物工程有限公司提供。美国热电FC型酶标仪。

1.3研究方法1）生物膜形成菌株筛选：生物膜筛选方法参照文献［5-6］适当加以改进。将菌株37℃复苏18 h，取无菌96孔板条，每孔加MH肉汤100 μL；制备0.5麦氏菌液，稀释40倍，取稀释菌液20 μL/孔加样（每孔的细菌量为5×104），平行加3孔。留3孔作为空白，同步将大肠埃希氏菌ATCC25922质控株作阴性对照。37℃培养24 h，盐水洗涤3次，倒置晾干后每孔加1 g/L结晶紫染色20 min，盐水洗涤3次，每孔加95%乙醇200 μL，混匀溶解，570 nm处酶标仪读数。以大肠埃希氏菌为阴性对照，OD值≥阴性对照OD值+ 3SD判断为产生物膜菌株。2）白藜芦醇最低抑菌浓度（MIC）测定：MIC定量测定依据美国国家临床实验室标准化委员会（NCCLS）的标准（M27-A）方案结合文献［7-8］适当改进。将白藜芦醇溶于二甲基亚砜，制成浓度为10 mg/mL的药液避光备用，实验时用MH肉汤将白藜芦醇倍比稀释成终浓度5000～2.44 μg/mL，依次加入到96孔细胞培养板中，每孔100 μL，每排1～12孔为1个系列浓度。最后1排作质控、空白、阳性对照各4孔，其中空白对照只加培养基不加菌液，质控对照以大肠埃希氏菌ATCC259223标准菌株作为实验菌株，空白对照和质控对照的其他实验步骤同临床菌株，阳性对照则采用一株产生物膜临床菌株，实验过程除不加白藜芦醇溶液外，其他步骤同临床菌株。取生物膜形成菌株37度18 h复苏。取无菌试管2支，每支加入MH液2 mL，第1支加入适量菌落，制备0.5麦氏菌液（菌量为1.5×108/mL），取该菌液10 μL加入第2支试管内，稀释200倍，混匀后取该浓度菌液100 μL/孔加样，平行加1行（每孔的细菌量约为5×104）。每行1个菌种。混匀后，加盖37℃培养24 h。以肉眼判断，无细菌生长的最低药物浓度孔（孔为透彻清亮者），即为白藜芦醇对受试菌的MIC。3）白藜芦醇抑制鲍曼不动杆菌生物膜的最低抑菌浓度（SMIC）测定：取生物膜形成菌株37℃18 h复苏，取无菌试管两支，每支加入MH 液2 mL，第1支加入适量菌落，制备0.5麦氏菌液（菌量为1.5×108/mL），取该菌液10 μL加入第2支试管内，稀释200倍，混匀后取该浓度菌液100 μL/孔加样（每孔的细菌量为5×104），平行加1排12孔。最后1排留作质控、空白、阳性对照各4孔，对照方法同上。加盖37℃培养24 h。生物膜形成后，倾去培养液，无菌生理盐水洗涤3次，拍干。无菌每排加入以肉汤倍比稀释的白藜芦醇溶液100 μL，继续培养24 h。用接种环挑取各孔培养液接种于营养琼脂平板，37℃培养过夜，观察最低抑菌浓度。

2　结　果

2.1白藜芦醇对鲍曼不动杆菌的抗菌作用见表1。结果示白藜芦醇对鲍曼不动杆菌有明显抑制作用，且随着药物浓度增加，对细菌增殖抑制作用逐渐增强。其MIC50为78.13 μg/mL；当药物浓度达到19.53 μg/mL时开始对鲍曼不动杆菌生物膜有抑制作用，其SMIC50为312.5 μg/mL。

表1　白藜芦醇对鲍曼不动杆菌抑制作用（μg/mL）

2.2白藜芦醇对鲍曼不动杆菌累计抑菌率见表2和图1。结果示，当白藜芦醇浓度达到2500 μg/mL时，其对鲍曼不动杆菌的抑菌率达到100%。

2.3白藜芦醇对鲍曼不动杆菌生物膜抑制作用见表3。从表中可看出，当药物浓度达到19.53 μg/mL时开始对鲍曼不动杆菌生物膜显示有抑制作用，其抑制生物膜生长的最低抑菌浓度（SMIC50）为312.5 μg/mL。

表2　白藜芦醇对鲍曼不动杆菌累计抑菌率

图1　白藜芦醇对鲍曼不动杆菌累计抑菌率

表3　白藜芦醇对鲍曼不动杆菌生物膜抑制作用（μg/mL）

3　讨　论

细菌生物膜是指细菌在生长过程中黏附于有生命或无生命物体表面，由其自身分泌的胞外多聚体及其基质网组成的三维结构的菌细胞群体［9］。细菌生物膜是细菌耐药性产生的重要原因［10］。研究证实，有生物膜形成能力的鲍曼不动杆菌菌株的耐药率显著高于无生物膜形成能力的菌株［11］。中草药可抑制鲍曼不动杆菌生物膜的形成［12］。白藜芦醇属于非黄酮类多酚化合物，是植物在遇到真菌感染或紫外线照射等不利条件时产生的植物防御素，对植物本身起保护作用，其具有抗癌、保护心血管系统、雌激素样作用和抗氧化、免疫调节、抗炎、抑菌等多种生理活性［13］。白藜芦醇对于真菌、球菌及部分革兰氏阴性杆菌具有很好抗菌活性，如金黄色葡萄球菌［14］、白色念珠菌、变形杆菌等［15］。

本研究结果表明，白藜芦醇对鲍曼不动杆菌的MIC50为78.13 μg/mL，MIC90为312.5 μg/mL，说明白藜芦醇具有较好的抗菌作用。利用微量稀释法观察白藜芦醇对鲍曼不动杆菌生物膜的抑制实验显示，白藜芦醇能有效地抑制和破坏鲍曼不动杆菌生物膜，其SMIC范围为19.53～5000 μg/mL，SMIC50为312.5 μg/mL。有作者推测，白藜芦醇能干扰细菌细胞壁的合成，同时损伤细胞膜，影响菌体细胞周期，干扰胞内物质合成，并且药物进入细胞壁后，使细胞酸碱和离子平衡失调，导致细胞器损伤，从而发挥抗菌作用［16］。

本研究为进一步利用中药研发清除鲍曼不动杆菌生物膜的新药提供了实验依据，由于本研究是体外实验，其临床应用价值还需更深入的研究。

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Inhibition Study of Resveratrol on Biofilm of Acinetobacter Bauman

YIN Wanghu，CAO Meilin，LI Jia，et al. Zhenjiang Hospital of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Zhenjiang 212003，China.

R285文献标志码：A

1004-745X（2016）06-1011-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.06.019

江苏省镇江市社会发展计划（SH2012051）

（2016-01-06）