土壤磷酸酶活性测定方法的改进

石春芳, 王志勇, 冷小云, 刘菊梅, 曹菊梅

(1. 内蒙古科技大学 数理与生物工程学院, 内蒙古 包头　014010；2. 内蒙古大学 生命科学学院, 内蒙古 呼和浩特　010021；3. 内蒙古包头市土壤肥料工作站, 内蒙古 包头　014010； 4 内蒙古包头北郊污水处理厂, 内蒙古 包头　014010)



土壤磷酸酶活性测定方法的改进

石春芳1,2, 王志勇3, 冷小云1, 刘菊梅1, 曹菊梅4

(1. 内蒙古科技大学 数理与生物工程学院, 内蒙古 包头014010；2. 内蒙古大学 生命科学学院, 内蒙古 呼和浩特010021；3. 内蒙古包头市土壤肥料工作站, 内蒙古 包头014010； 4 内蒙古包头北郊污水处理厂, 内蒙古 包头014010)

磷酸酶是土壤中非常重要的酶类,其活性可作为评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标，快速、简便、准确的测定方法对磷酸酶的研究具有促进作用。在磷酸苯二钠比色法基础上进行改进,用酶标板/酶标仪测定吸光度,不仅减少了试剂使用量,而且缩短了测定时间,在样品量较大时可降低操作人员的工作强度。

土壤； 磷酸酶活性； 测定方法

土壤酶来源于土壤微生物的生长代谢活动和植物根系分泌物,主要参与土壤中物质的生物转化和养分形态转化。通过分析土壤酶活性大小,可以间接考察土壤微生物群落活性、土壤生物化学反应程度、土壤肥力状况及土壤污染状况[1-4]。磷酸酶是土壤中一类重要的酶类,参与有机磷的转化,可加速有机磷的脱磷速度,其活性高低与土壤中有机磷含量和pH值相关,可作为评价土壤磷素生物转化方向和强度的指标[5-7]。磷酸酶活性的测定,其基本原理是根据酶促作用生成的有机基团量或无机磷量来计算磷酸酶活性[8-9],前一种方法通称为有机基团含量法,是较为常用的测定磷酸酶活性方法,后一种称为无机磷含量法。磷酸苯二钠比色法即是一种采用有机基团含量法测定磷酸酶活性的方法,所用基质为磷酸苯二钠,利用分光光度计测定A660[10-12]。本实验的改进之处是缩小显色液体积,吸光度测定利用酶标仪,在减少试剂用量的同时,缩短了读数时间,当测定样本量较大时,可降低操作人员的工作强度。

1　实验材料与方法

1.1仪器和主要试剂

仪器:酶标仪、酶标板、移液枪、恒温培养箱。

试剂:硼酸盐缓冲液，0.5%磷酸苯二钠，氯代二溴对苯醌亚胺试剂，甲苯，0.3%硫酸铝溶液，酚标准溶液(0.01mg/mL)。

1.2实验方法

1.2.1原有方法

实验步骤:称5g土样置于200mL三角瓶中,加2.5mL甲苯,轻摇15min后加入20mL、0.5%用硼酸盐缓冲液配制的磷酸苯二钠,摇匀后放入恒温箱,37 ℃下培养24h；然后在培养液中加入100mL、0.3%硫酸铝溶液并过滤；吸取3mL滤液于50mL容量瓶中,然后按绘制标准曲线方法显色。

标准曲线绘制:取0、1、3、5、7、9、11、13mL酚工作液,置于50mL容量瓶中,每瓶加入5mL硼酸缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂,显色后稀释至刻度；30min后,在分光光度计上660nm处比色。以显色液中酚浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。

1.2.2改进方法

实验步骤:称5g土样置于200mL三角瓶中,加2.5mL甲苯,轻摇15min后,加入20mL用硼酸盐缓冲液配制的0.5%磷酸苯二钠,摇匀后放入恒温箱,37 ℃下培养24h；然后在培养液中加入100mL、0.3%硫酸铝溶液并过滤；吸取0.3mL滤液于10mL试管中,然后按绘制标准曲线方法显色。

标准曲线绘制:取0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mL酚工作液,置于10mL试管中,每管加入0.5mL硼酸缓冲液和1滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂,显色后稀释至5mL；30min后,吸取200μL加入酶标板,在酶标仪上测定A660。以显色液中酚浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线。

2　结果与讨论

2.1标准曲线绘制

用移液枪分别吸取不同体积的酚工作液(0.01g/L)至10mL试管中,分别加入0.5mL硼酸缓冲液,1滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂,显色后分别加入相应体积的蒸馏水,显色液总体积为5mL；30min后用移液枪吸取200μL显色液至于酶标板中,在酶标仪中测定A660。

显色液体系及标准曲线分别见表1和图1。

表1　标准曲线绘制时的显色液体系

图1　酚标准曲线

由图1可见,回归系数为0.9983,线性较好。

2.2两种方法对比

原方法与改进方法的显色液用量的比较见表2。

表2　两种方法显色液用量的比较

由表2可见,改进方法中显色液总体积大幅度降低,所需试剂使用量减少到原方法的1/10,可同时测定的样品数由5个增加到96个,改进方法可大大缩短样品分析测定时间,减少样品及试剂使用量。

2.3土壤样品碱性磷酸酶活性测定结果比较

利用两种方法测定4个土壤样品的碱性磷酸酶活性,测定结果见表3。

表3　土壤碱性磷酸酶活性

由表3可见,改进方法测定的土壤碱性磷酸酶活性与原方法测定结果非常接近,t检验表明,两种方法测定结果之间无显著差异(p=0.348)。

3　结论

(1) 改进后的土壤碱性磷酸酶活性测定方法,可缩短样品检测分析时间,减少试剂的使用量。

(2) 利用改进方法绘制的酚标准曲线结果表明线性回归较好。

(3) 对4个土壤样品碱性磷酸酶活性测定结果表明,改进方法与原方法无显著差异,样品量较大时推荐采用改进方法进行测定。

References)

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Improvementofsoilphosphataseactivitymeasurementmethod

ShiChunfang1,2,WangZhiyong3,LengXiaoyun1,LiuJumei1,CaoJumei4

(1.SchoolofMathematics,PhysicsandBiologicalEngineering;InnerMongoliaUniversityofScience&Technology,Baotou014010,China; 2.CollegeofLifeSciences,InnerMongoliaUniversity,Hohhot010021,China; 3.SoilandFertilizerStationofBaotou,Baotou014010,China；4.BaotouNorthSuburbWastewaterTreatmentPlant,Baotou014010,China)

Phosphatasewasveryimportantsoilenzymeswhichhasbeeninvolvedintheconversionoforganicphosphorusinthesoil,anditsactivitycouldbevaluedasindicatorofsoilphosphorusbiotransformationdirectionandstrength.Thefast,simpleandaccuratemeasuringmethodhasafacilitatingroleinphosphatasesresearch.ImprovementmethodisbasedonDisodiumphosphatebenzenecolorimetricmethod,andtheabsorbancewasmeasuredbymicrotiterplates/microplate.Notonlytheamountofreagentusehasbeenreduced,butalsothemeasurementtimehasbeenshortened,andtheoperators’workintensitycanbereducedwhentherewerelotsofsamples.

soil；phosphataseactivity；measurementmethod

DOI:10.16791/j.cnki.sjg.2016.07.012

2015-11-16

包头市科技计划项目(2014Z1010-3)；内蒙古自治区自然科学基金项目(2015MS0332)

石春芳(1978—)，女(蒙古族)，内蒙古包头，硕士，副教授，主要从事环境生物技术方面的科研工作.

E-mail：13848273693@163.com

S151.9

B

1002-4956(2016)7-0048-02