水温、pH值和光照对斑马鱼受精卵孵化率的影响

陈楠，高雯，张磊，董罗涛，沈泽恩，魏文志，付立霞（江苏省人畜共患病学重点实验室，扬州大学动物科学与技术学院，江苏　扬州　225009）

水温、pH值和光照对斑马鱼受精卵孵化率的影响

陈楠，高雯，张磊，董罗涛，沈泽恩，魏文志，付立霞
（江苏省人畜共患病学重点实验室，扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州225009）

摘要：分别通过单因素实验和正交实验探究水温、pH值和光照对斑马鱼受精卵孵化率的影响。依次进行的单因素实验显示，水温28℃，pH值7.5，光照强度100 lx，光周期10L∶14D时孵化率最高。正交实验结果表明上述因素对斑马鱼受精卵孵化率的影响为:水温＞pH＝光照强度＞光照周期，理论最佳孵化条件为水温28℃，pH值8.0，光照强度100l x，光周期12L∶12D。在孵化过程中，受精卵孵化时间随着孵化温度的提高而缩短，且在发育过程中存在不同步现象。

关键词：斑马鱼；孵化率；水温；pH值；光照

斑马鱼，又称蓝条鱼、花条鱼和斑马担尼鱼，隶属于鲤科（Cyprinidae），短担尼鱼属（Brachydanio），是原产于南亚的一种亚热带小型淡水观赏鱼类。由于易饲养，个体小（成鱼体长仅为3～5 cm），繁殖快（从受精卵到性成熟只需3个月左右），可周期产卵（产卵周期约10 d左右），而且早期胚胎完全透明，便于观察内部结构，这使得斑马鱼成为生物学研究的最佳脊椎动物模型。随着斑马鱼基因组测序工作的完成与发布，斑马鱼的应用领域不断拓展，目前斑马鱼已被广泛应用于发育生物学、遗传学、免疫学、药物学、毒理与环保等诸多方面的研究［1-2］。

持续稳定的斑马鱼胚胎及苗种供应是开展相关研究的重要保障。为避免市售斑马鱼质量的良莠不齐，一些实验室建立了斑马鱼繁育、养殖系统以保证研究的顺利进行。孵化是斑马鱼人工繁育的重要环节，在一定程度上决定着后续工作的成败，不过当前关于斑马鱼孵化的相关资料仅限于技术性描述，缺乏系统性的实验设计［3-4］。鉴于此，本研究拟从水温、pH值及光照等方面对斑马鱼受精卵的孵化率进行比较研究，探索斑马鱼受精卵孵化的最佳条件，提高其孵化效益，加速其在相关领域的应用研究。

1　材料和方法

1.1斑马鱼

实验用斑马鱼购自南京夫子庙水族市场，日常饲养于室内水族箱内，水温控制于28℃，投喂商用配合饲料，每天2次，分别为9：00及16：00，投饲量以斑马鱼在10 min内吃完为好。每1～2 d吸污一次，并更换部分养殖用水，定时用增氧泵进行增氧。繁殖前半月，将雌、雄亲鱼进行分开饲养，并投喂活性饲料进行营养强化，活性饲料包括去壳卤虫卵、草履虫及室外捞取并经聚维酮碘浸泡消毒清洗后的红虫等。

1.2受精卵

实验用受精卵通过斑马鱼的人工繁殖获得。具体操作为：先将充分曝气的自来水注入经消毒的水族缸中，然后放入小型繁殖网箱（44 cm×24 cm×30 cm），网箱网孔直径约2 mm，通过侧边吸盘吸附于水族缸壁，保持箱体底部离缸底10 cm左右以防止亲鱼产卵后吞噬鱼卵。于傍晚时分将亲鱼放入布置好的繁殖箱中，雌雄比例2∶3，向繁殖缸中补充部分曝气自来水以刺激亲鱼发情产卵。待亲鱼产卵后将其移出繁殖缸，用管口平滑圆润大口吸管从缸底缓慢吸取质量良好的受精卵用于下一阶段的实验。

1.3单因素实验

为获得各因素的最佳取值范围，首先进行单因素孵化实验，每个因素水平设2个重复，随机选取30粒受精卵于1 000 mL烧杯内进行人工孵化。为防止缺氧造成受精卵死亡，用吸管将受精卵轻轻吹散，使其均匀分布于烧杯底部，并不时利用吸管补充氧气。在孵化过程中密切观察受精卵的变化情况，及时挑出死卵，防止水霉的发生。

孵化水温分别设置为24、26、28、30℃；pH值分别为6.5、7、7.5、8、8.5；光照强度分别为50、100、200、300、400 lx；光周期分别为8L∶16D（阿拉伯数为小时数，L为光照，D为黑暗避光，后同）、10L∶14D、12L∶12D、14L∶10D，实验期间当某个组的光照时间结束后，立即将其移入遮光区域，其他组则继续正常接受光照。

1.4正交实验

在单因素实验的基础上根据正交实验的设计原理，以受精卵孵化率为实验目标，设置水温、pH、光照强度和光照周期4个因素，每个因素设置3个水平，进行4因素3水平的正交实验，具体因素水平见表1。实验期间密切观察受精卵胚胎的发育情况，并进行相应记录，胚胎的发育分期参照Kimmel等的描述［5］。

1.5数据统计

按照下列公式计算各实验组孵化率：

孵化率=出膜苗数/孵化卵数×100%对正交实验所得实验数据，采用极差法进行统计分析。

表1　正交实验的因素与水平

2　结果

2.1单因素实验

在设定的水温范围内，斑马鱼受精卵的孵化率为55%～85%，其中水温24℃时孵化率最低，为55%。随着水温的升高，孵化率亦开始增加，并于28℃时达到峰值85%，随后孵化率又逐渐下降，30℃水温时孵化率为75%。不同pH条件下斑马鱼受精卵的孵化率亦有较大差异，当pH在6.5～7.5之间时，孵化率为81.7%～90%，呈上升趋势。但当pH超过7.5时，孵化率则突然大幅下降，pH 8.0和8.5时的孵化率分别为75%和76.7%（图1）。

图1　不同水温（■）和pH（●）下受精卵孵化

在设定的光照强度范围内，50 lx时孵化率为88.3%，100 lx时孵化率达到最高，为91.7%。之后随着光照强度的进一步增加，孵化率呈下降趋势，400 lx时孵化率最低，为76.7%。在所设定的四组不同光周期中，10 h光照组（10L∶14D）孵化率最高，为71.7%；相较之下，14 h光照组（14L∶10D）孵化率最低，仅为45%（图2）。

2.2正交实验

根据L9（34）正交设计表，一共开展9个组合的实验，具体结果见表2，其中A2B1C2D3组合孵化率最高，为85%。后续进行的极差分析显示RA＞RB=RC＞RD，即四因素对斑马鱼受精卵孵化率的作用由大到小依次为：水温，光照强度，pH，光照周期。根据K值推断最佳孵化条件为A2B3C2D3，即水温为28℃、pH 为8、光照强度为100 lx、光周期为12L∶12D时，斑马鱼受精卵的孵化率最高（表3）。

2.3斑马鱼的胚胎发育

图2　不同光照强度（◆）和光周期（▌）下受精卵孵化率

实验中受精卵孵化时间随着孵化温度的提高而缩短，且在发育过程中存在不同步现象。在28℃水温条件下，从受精到出膜约需3 d左右时间，历经受精卵期，卵裂期、囊胚期、原肠胚期、体节期、咽部期和孵化期7个主要阶段，每一阶段历时各不相同，其中受精卵期发生于0～0.75 h，卵裂期为0.75～2.5 h，囊胚期为2.5～6.0 h，原肠胚期为6～18 h，体节期为18～32 h，咽部期为32～46 h，孵化期为46～70 h。

3　讨论

鱼类受精卵的孵化涉及一系列复杂的生理、生化过程，会受到诸多因素的影响。水温和pH值可直接影响各种孵化相关酶类的活性，进而对孵化进程产生作用［6-7］。孵化与接收光照的时间、强度也有密切的关系，这是因为充足的光照不但有利于水温的提高，更重要的是可以消毒杀菌，使受精卵在孵化期间免遭水霉的侵害，而且光周期的变化可以直接启动生物的节律［8-9］。

表2　正交实验方案与结果

表3　极差分析表

通常，不同鱼类适宜的孵化条件各不相同，即使同一种鱼，在不同的环境条件中生存较长时间后，其适宜的生长、发育条件也会发生改变［10］。就斑马鱼而言，董武等［4］认为适宜的胚胎发育温度为25～31℃，袁宗勤等［10］通过观察比较斑马鱼受精卵在不同温度条件下的病死率、孵化率等指标后，推断28℃为最佳孵化温度，与本研究结果一致。

目前尚无关于pH值、光照等对斑马鱼受精卵孵化率影响的研究报道，但在相关文献中一般建议饲养斑马鱼时保持pH为7.0～8.0，光照强度为54～324 lx，光照期为14L∶10D［11-12］。本研究中，无论是单因素实验还是正交实验，适宜pH值和光照强度均在建议范围之内，但适宜的光周期却有所不同。单因素实验中光周期为10L∶14D时孵化率最高，正交实验中最佳孵化光周期则为12L∶12D，这可能与鱼类的受精卵孵化不宜长时间光照有关，类似现象在大银鱼卵的孵化中也曾有过报道［13］。

本次研究中另一个值得注意的现象就是单因素实验所得出的最佳孵化条件与通过正交实验推断的最佳孵化条件并不完全一致，除上述光周期之外，pH值也不相同，单因素实验中pH值为7.5时孵化率最高，但在正交实验中，pH值为8时孵化率最高，这可能是由于其他因素互作效应的影响。相较于单因素实验每次只能关注于一个因素，正交实验更适合于多因素多水平实验条件的研究，只需选择适当的正交表来安排实验，即可找到诸多因素中对实验指标有显著影响的主要因素，并确定使实验指标达到最佳的因素水平，而且相关结论具有更好的重复性［14］。目前，正交实验已广泛应用于许多领域生产工艺或条件的优化［15］，不过在鱼类受精卵孵化条件的优化方面尚鲜有报道。此外，在孵化过程中，斑马鱼的胚胎发育存在不同步现象，且每一阶段经历的时间与Kimmel等的研究报道不完全一致，这可能与孵化条件不同有关。

参考文献：

［1］贾顺姬，孟安明.中国斑马鱼研究发展历程及现状［J］.遗传，2012，34（9）:1082-1088.

［2］李阔宇，潘鲁湲，孙永华.斑马鱼资源的开发保藏与国家斑马鱼资源中心 ［J］.中国实验动物学报，2014，22（6）:93-98，105.

［3］Ruzicka L，Bradford YM，Frazer K，et al.The zebrafish model organism database:Updates and new directions［J］.Genesis，2015，53（8）：498-509.

［4］董武.斑马鱼及相关实验技术［M］.青岛:中国海洋大学出版社，2006.

［5］Kimmel CB，Ballard WW，Kimmel SR，et al.Stages of embryonic development of the zebrafish［J］.Developmental Dynamics，1995，203（3）：253-310.

［6］吴晗，白俊杰，姜鹏.pH对转红色荧光蛋白基因唐鱼孵化率和仔鱼存活的影响 ［J］.大连海洋大学学报，2014，29 （1）：27-30.

［7］彭俊，王辉，强俊，等.温度和盐度对吉富品系尼罗罗非鱼受精率和孵化率的联合影响 ［J］.中国水产科学，2011，18 （4）：847-856.

［8］许秋瑾，颜昌宙，刘力亚，等.沉水植物对斑马鱼鱼卵孵化及仔鱼生长的影响［J］.环境科学研究，2004（17）：73-76.

［9］王明勇，黄国栋，王晗.斑马鱼生物钟研究进展［J］.遗传，2012，34（9）：1133-1143.

［10］袁宗勤，于燕光，丛日浩，等.温度对斑马鱼胚胎发育的影响研究［J］.现代农业科学，2009，16（4）：188-189，220.

［11］Lawrence C.The husbandry of zebrafish（Danio rerio）:A review［J］.Aquaculture，2007，269（1-4）：1-20.

［12］Matthews M，Trevarrow B，Matthews J.A virtual tour of the Guide for zebrafish users［J］.Lab Animal（NY），2002，31 （3）：34-40.

［13］戈志强，朱江，朱玉芳，等.不同光照、温度对大银鱼受精卵孵化率的影响［J］.淡水渔业，2003，33（5）：23-24.

［14］盛永莉.正交试验设计及其应用 ［J］.济南大学学报，1997，7（3）：69-73.

［15］王玄静.正交试验设计的应用及分析 ［J］.兰州文理学院学报，2016，30（1）：17-22.

资助项目：江苏省人畜共患病重点实验室开放基金（R1510）；扬州大学大学生学术科技创新基金项目（x2015680）

中图分类号：Q173

文献标志码：A

文章编号：1004-2091（2016）07-0027-5

doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2016.07.006

收稿日期：（2016-02-22）

作者简介：陈楠（1993-），女，学士，研究方向为水产动物医学；

通讯作者：付立霞，男，博士，E-mail:dynamicren@163.com

Effects of water temperature，pH and light on the hatching rate of zebrafish oosperm

Chen Nan，Gao Wen，Zhang Lei，Dong Luotao，Shen Zeen，Wei Wenzhi，Fu Lixia
（Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis，College of Animal Science，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China）

Abstract：The effects of water temperature，pH and light intensity and period on the hatching rate of ze－brafish oosperm were explored by single factor experiments and orthogonal test.The optimum value for the four factors，deduced from the results of single factor experiments，were 28℃，7.5，100 lx and 10L∶14D，respectively，for the hatching rate in the condition of one of them was highest among their groups.However，the results of orthogonal test indicated that the best hatching condition could be the combination of 28℃，8，100 lx and 10L: 14D，and the influence order of individual factor was:water temperature＞pH＝light intensity＞light period.In the process of incubation，the hatching time became shorter with the increase of water temperature and asynchrony was observed in the development of zebrafish.

Key words：zebrafish；hatching rate；water temperature；pH；light