六君子汤提取物抑制食管癌Ec9706细胞增殖及其对信号转导和转录活化因子3信号通路的影响

崔姗姗，高小玲，王慧慧，吴耀松，尹素改，陈玉龙



·论著·

·中医·中西医结合研究·

六君子汤提取物抑制食管癌Ec9706细胞增殖及其对信号转导和转录活化因子3信号通路的影响

崔姗姗，高小玲，王慧慧，吴耀松，尹素改，陈玉龙

目的研究六君子汤提取物对食管癌Ec9706细胞增殖的抑制作用及其对信号转导和转录活化因子3(STAT3)信号通路的影响。方法于2013—2015年，采用70%乙醇提取六君子汤，正丁醇、乙酸乙酯及水提法过夜萃取，用MTT法观察提取物对Ec9706细胞活性的影响，选取最优提取部位，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法观察六君子汤乙酸乙酯部位对Ec9706细胞分泌相关细胞因子〔包括白介素6(IL-6)、转化生长因子β1(TGF-β1)、血管内皮生长因子(VEGF)〕的影响，采用Western-blotting法测定六君子汤乙酸乙酯部位对食管癌Ec9706细胞STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表达的影响。结果对照组、六君子汤70%乙醇部位、六君子汤正丁醇部位、六君子汤水提部位Ec9706细胞OD值比较，差异有统计学意义(F=448.90，P<0.01)。药物处理组对Ec9706细胞生长的抑制效果依次为：六君子汤正丁醇部位>六君子汤70%乙醇部位>六君子汤水提部位。六君子汤乙酸乙酯部位Ec9706细胞OD值比较，差异有统计学意义(F=19.78，P<0.001)。在250 μg/ml时，六君子汤70%乙醇部位、六君子汤正丁醇部位、六君子汤水提部位对Ec9706细胞的抑制率分别为7.31%、23.24%、-25.07%，而在200 μg/ml时，六君子汤乙酸乙酯部位对Ec9706细胞的抑制率为77.03%，抑制效果明显优于其他部位，故筛选的有效部位为六君子汤乙酸乙酯部位。应用概率法计算六君子汤乙酸乙酯部位抑制率IC35、IC50、IC70，代表低、中、高浓度，相应的浓度为63.08、93.00、133.70 μg/ml。对照组、六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组IL-6、TGF-β1、VEGF水平比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；其中六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组IL-6、TGF-β1、VEGF水平低于对照组(P<0.05)。对照组、六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组STAT3、p-STAT3表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组STAT3、p-STAT3表达水平低于对照组(P<0.05)。结论六君子汤不同试剂提取物中，乙酸乙酯提取物抑制食管癌细胞增殖作用最强，其抑制作用可能与调节STAT3信号通路有关。

食管肿瘤；六君子汤；提取物；乙酸乙酯；STAT3

崔姗姗，高小玲，王慧慧，等.六君子汤提取物抑制食管癌Ec9706细胞增殖及其对信号转导和转录活化因子3信号通路的影响[J].中国全科医学，2016，19(24)：2948-2952.[www.chinagp.net]

CUI S S，GAO X L，WANG H H，et al.Inhibition of extract of Liujunzi decoction on Ec9706 cells growth of esophageal carcinoma and its effects on signaling pathway of signal transducers and activations of transcripition 3[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2948-2952.

食管癌(esophageal carcinoma)是人类常见的恶性肿瘤之一，居全球癌症所致死因的第6位[1-2]，5年生存率不足20%[3-4]。中医药学对食管癌具有深刻的认识和悠久的诊疗历史，健脾和胃法是食管癌中医临床辨治的基本法则，六君子汤是健脾和胃的代表方剂。六君子汤水煎剂和乙醇提取物可直接抑制食管癌Ec9706细胞的体外增殖，下调肿瘤细胞血管内皮生长因子(VEGF)和白介素6(IL-6)的分泌，从而阻止肿瘤细胞引起的血管生成、内皮细胞的增殖及迁移和小管形成[5-6]，但具体分子作用机制仍需探究。信号转导和转录活化因子3(STAT3)作为一种重要的核转录因子介导的信号，与食管癌发生、发展和转移关系密切[7-8]。为了研究六君子汤对食管癌细胞增殖的抑制作用机制，本实验采用乙醇、正丁醇、乙酸乙酯及水提法提取六君子汤，观察这4种试剂的提取物对食管癌细胞增殖的抑制作用，并研究其对STAT3信号通路的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验时间与实验材料2013—2015年，人食管鳞癌细胞株Ec9706，由河南中医学院分子生物中心提供，本实验室传代培养。

1.1.2实验药品六君子汤的药物组成：人参3.0 g、生白术4.5 g、茯苓3.0 g、生甘草3.0 g、陈皮3.0 g、清半夏4.5 g。上述药物均购于北京同仁堂郑州药店有限责任公司，经河南中医药大学苗艳艳副研究员鉴定皆为正品。

1.1.3主要试剂95%乙醇分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)，乙酸乙酯分析纯、正丁醇分析纯(天津富宇精细化工有限公司)，胰蛋白酶消化液(Solarbio公司，批号：20130424)，胎牛血清(Gibco公司，批号：1133067)，RPMI Medium1640(Solarbio公司，批号：20130416)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Solarbio公司，批号：M8180)，二甲基亚砜(DMSO，Amresco，批号：302A0315)，IL-6、转化生长因子β1(TGF-β1)、VEGF酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测试剂盒(Boster公司，批号：13110971028、2271072108、25310561028)，凝胶配制试剂盒(Boster公司，批号：09K03A38)，磷酸酶抑制剂(Thermo公司，批号：OD182286)，苯甲基磺酰氟(PMSF)(Boster公司，批号：09F05A78)，RIPA裂解液(Boster公司，批号：09F12B05)，兔抗人STAT3(proteintech公司，批号：10253-2-AP)，磷酸化STAT3(p-STAT3)(Tyr-705)(abcam，批号：ab76315)，兔抗人β-tublin(santacruz公司，批号：L1713)，山羊抗兔IgG(proteintech公司，批号：SA00001-2)，ECL Plus超敏发光液A和B(Solarbio公司，批号：20141118)。

1.1.4主要仪器CO2培养箱(德国Eppendorf公司)，超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)，荧光倒置相差显微镜(德国Laica公司)，ELx-800型酶标仪(BIO-TEK公司)，RE-3000B旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，垂直电泳槽、湿转仪(上海天能仪器公司)，全能型凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司)，低温高速冷冻离心机(HITACHICR 226)。

1.2实验方法

1.2.1药物提取

1.2.1.1乙醇回流提取称取六君子汤100副药量(2 100 g)，粉碎机制成粗粉后混匀各药。以M(药物重量)∶V(70%乙醇体积)=1∶8混匀，置于加热套内，连接回流冷凝装置和真空泵。设置加热温度为50 ℃，待70%乙醇浸液沸腾后开始计时，1.5 h后，关闭电源，过滤药液，室温放置。将滤得药渣重复上述操作，进行第2次醇提，时间为1 h，过滤后与第1次醇提液混合，静置过夜，取上清液，药渣弃之。

1.2.1.2萃取回收乙醇提液置无醇味后浓缩药液，浓缩至体积大约与生药总重量相当，即每毫升含1 g生药。量取1/20体积浓缩液作为70%乙醇部位，余下浓缩液(19/20体积)与乙酸乙酯体积比为2∶1进行萃取，第1次萃取前需静置过夜。萃取6次，每隔2 h将分液漏斗上下颠倒7～8次。合并6次萃取液，负压抽滤，收集滤液，置于旋转蒸发仪中，减压回收乙酸乙酯后，转移至蒸发皿，置58 ℃恒温水浴锅上继续浓缩、低温真空干燥，刮药、称重。收集最后一次乙酸乙酯萃取时下层水相液体，挥发残留乙酸乙酯，进行水饱和正丁醇萃取，操作同前(2∶1萃取)。收集最后一次正丁醇萃取时下层水相，即水部位。最终获得各部位提取物。

1.2.2细胞培养Ec9706细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，置于37 ℃饱和湿度、体积分数为5% CO2培养箱内培养，2～3 d换液1次，3～4 d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3MTT检测六君子汤提取物对人食管鳞癌Ec9706细胞增殖的影响取处于对数生长期的Ec9706细胞，按104/孔的细胞密度接种于96孔板中，将96孔板置于CO2培养箱中孵育24 h，弃去培养液。70%乙醇部位、正丁醇部位、水提部位分别设置相同的浓度梯度(125、250、500、1 000 μg/ml)；乙酸乙酯部位设置6个浓度梯度(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 μg/ml)；设置含相同体积分数DMSO的RPMI 1640培养基作为对照组。细胞加提取物培养48 h后，弃去培养液，每孔加入0.5 g/L MTT液100 μl，继续培养4 h，吸去上液，每孔加入DMSO 150 μl，在摇床上轻轻震荡15 min，待孔内紫色结晶完全溶解后用酶标仪在570/630 nm处测各孔吸光度(OD值)，计算各用药组的平均抑制率，细胞抑制率=(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100%。实验重复4次，取平均值。

1.4ELISA试剂盒检测六君子汤乙酸乙酯提取物对Ec9706细胞分泌相关细胞因子的影响取处于对数生长期的Ec9706细胞，按104/孔的细胞密度接种于96孔板中，将96孔板置于CO2培养箱中孵育24 h，弃去培养液，加入IC35浓度63.08 μg/ml、IC50浓度93.00 μg/ml乙酸乙酯提取物，培养48 h后，收集各瓶细胞上清液，以1 500 r/min离心5 min，离心半径18 cm，重复离心1次，将上清液转移至对应离心管中，共5管(低、高浓度各2管，对照1管)，标记，-20 ℃保存。采用ELISA试剂盒检测Ec9706细胞IL-6、TGF-β1、VEGF水平，操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5Western-blotting法测定细胞中STAT3和p-STAT3蛋白的表达细胞加乙酸乙酯提取物培养48 h后，终止培养，收集各皿上清液，标记各管，以1 500 r/min离心5 min，离心半径18 cm，弃上清液；皿内加入2 ml 4 ℃ 1×PBS，用细胞刮刀缓慢匀速的刮下贴壁细胞，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度；配制10%分离胶，上样蛋白量20 μg/孔，浓缩胶和分离胶所用电压和时间分别设定为80 V/30 min和120 V/60 min；转膜、杂交、将NC膜放置于保鲜膜上，将ECL化学发光显色液A和B按1∶1配置后均匀加到膜上。用全能型凝胶成像分析系统拍照并分析目标条带的光密度值。实验重复3次，取平均值。

2　结果

2.1六君子汤提取物影响人食管鳞癌Ec9706细胞生长有效部位的筛选对照组、六君子汤70%乙醇部位、六君子汤正丁醇部位、六君子汤水提部位Ec9706细胞OD值比较，差异有统计学意义(F=448.90，P<0.01)；其中六君子汤水提部位各浓度对Ec9706细胞生长有促进作用；六君子汤70%乙醇部位、六君子汤正丁醇部位均存在最高浓度(1 000 μg/ml)抑制细胞生长而中低浓度促进或抑制细胞生长的特点。整体药物处理组对Ec9706细胞生长的抑制效果依次为：六君子汤正丁醇部位>六君子汤70%乙醇部位>六君子汤水提部位(见表1)。六君子汤乙酸乙酯部位Ec9706细胞OD值比较，差异有统计学意义(F=19.78，P<0.001，见表2)。在250 μg/ml时，六君子汤70%乙醇部位、六君子汤正丁醇部位、六君子汤水部位对Ec9706细胞的抑制率较弱，分别为7.31%、23.24%、-25.07%，而在200 μg/ml时，六君子汤乙酸乙酯部位对Ec9706细胞的抑制率为77.03%，抑制效果明显优于六君子汤70%乙醇部位、六君子汤正丁醇部位、六君子汤水部位，故重点研究六君子汤乙酸乙酯部位。

Table 1Dose-effect relationship of the inhibition of Liujunzi decoction extract on the proliferation of Ec9706 cells

组别浓度(μg/ml)OD值抑制率(%)对照组-1.532±0.011-六君子汤70%乙醇部位10001.369±0.06310.645001.531±0.1110.072501.644±0.0757.311251.742±0.067-13.73六君子汤正丁醇部位10000.483±0.064a68.495001.204±0.059a21.392501.176±0.162a23.241251.584±0.170-3.37六君子汤水提部位10001.552±0.037-1.285001.822±0.057a-18.912501.916±0.173a-25.071251.917±0.259a-25.13

注：-为无此数值；与对照组比较，aP<0.05；抑制率为负值时代表药物促进了Ec9706细胞生长

2.2六君子汤乙酸乙酯部位对人食管癌Ec9706细胞分泌细胞因子的影响应用概率法计算六君子汤乙酸乙酯部位抑制率IC35、IC50、IC70，代表低、中、高浓度，记为六君子汤：IC35%=63.08 μg/ml，IC50%=93.00 μg/ml，IC70%=133.70 μg/ml。对照组、六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组IL-6、TGF-β1、VEGF水平比较，差异均有统计学意义(P<0.01)；其中六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组IL-6、TGF-β1、VEGF水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表3)。2.3六君子汤乙酸乙酯部位对人食管癌Ec9706细胞STAT3和p-STAT3表达的影响对照组、六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组STAT3、p-STAT3表达水平比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其中六君子汤低浓度组、六君子汤中浓度组STAT3、p-STAT3表达水平低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05，见表4、图1)。

Table 2Dose-effect relationship of the inhibition of the ethyl acetate part of Liujunzi decoction on the proliferation of Ec9706 cells

组别浓度(μg/ml)OD值抑制率(%)对照组-1.273±0.150-六君子汤乙酸乙酯部位200.000.292±0.012a77.03100.000.142±0.020a88.8750.000.801±0.268a37.0425.001.071±0.23215.8212.501.199±0.1355.816.251.230±0.0223.51

注：-为无此数值；与对照组比较，aP<0.05

Table 3Comparison of the levels of Liujunzi decoction on Ec9706 cell secreting cytokines in control group,low concentration and medium concentration groups

组别IL-6TGF-β1VEGF对照组125.05±2.17655.41±253.83820.01±126.51六君子汤低浓度组100.77±21.16a38.46± 5.99a574.94±43.56a六君子汤中浓度组73.99±7.30a37.07± 4.57a598.28±80.55aF值15.4823.678.99P值<0.01<0.01<0.01

注：与对照组比较，aP<0.01；IL-6=白介素6，TGF-β1=转化生长因子β1，VEGF=血管内皮生长因子

Table 4Comparison of the expression levels of p-STAT3 and STAT3 in Ec9706 cells of the control group,low concentration and medium concentration groups of Liujunzi decoction

组别STAT3p-STAT3对照组1.22±0.271.19±0.18六君子汤低浓度组0.82±0.15a0.19±0.12a六君子汤中浓度组0.68±0.09a0.22±0.05aF值3.242.25P值0.04<0.01

注：与对照组比较，aP<0.05；STAT3=信号转导和转录活化因子3，p-STAT3=磷酸化STAT3

注：STAT3=信号转导和转录活化因子3，p-STAT3=磷酸化STAT3

图1对照组、六君子汤低浓度组和六君子汤中浓度组对Ec9706细胞STAT3和p-STAT3表达水平

Figure 1Expression levels of p-STAT3 and STAT3 in Ec9706 cells of the control group,the low concentration and medium concentration groups of Liujunzi decoction

3　讨论

中药复方是中医临床普遍应用的治疗方式。目前，对中药复方的研究已不局限于水煎剂，在传统中医药理论和现代科学理论与技术的结合下，研究复方有效部位群，不仅保留了原中药性味功能，而且通过研究复方制剂药理、质量可控的化学成分体系、规范制剂工艺等，保证了用药稳定性和安全性[9]。中药复方的有效部位是指具有相近化学性质的一类化合物(药效成分群)[10]。“有效浸出物─有效部位(群)─有效成分”这种研究思路为现阶段大多数科学工作者所采取。

本实验中，将六君子汤用70%乙醇加热回流提取后进行乙酸乙酯和正丁醇萃取，首次将各部位作用于Ec9706细胞，用MTT法对六君子汤提取物不同浓度培养的Ec9706细胞进行细胞毒性检测，初步筛选出乙酸乙酯部位作为本实验的有效部位。结果显示不同浓度的乙酸乙酯部位提取物均不同程度地抑制Ec9706细胞增殖，且浓度梯度低于70%乙醇部位、正丁醇部位和水提部位。乙酸乙酯可提取出极性较小的游离生物碱、有机酸、黄酮及香豆素等；正丁醇可提出皂苷等极性较大物质；乙醇可提出苷类、生物碱或有机酸盐类；水可提取出糖类、氨基酸、蛋白质、无机盐类等水溶性成分。六君子汤乙酸乙酯部位可完全溶解于DMSO，但在工作液配制过程中，RPMI 1640溶液中却出现了不溶物，因而实际发挥作用的成分可能含量更少。

研究表明，肿瘤细胞在发生发展、浸润转移过程中可通过自分泌-旁分泌形式产生一系列细胞因子，如VEGF、白介素(IL)-10、IL-6、前列腺素E2(PGE2)、TGF-β等，参与肿瘤细胞介导的免疫抑制对抗机体的免疫反应[11]。本实验选取六君子汤乙酸乙酯部位对Ec9706细胞抑制率分别为35%和50%时相应的浓度，作为中、低浓度组，应用ELISA技术检测上清液中IL-6、TGF-β1和VEGF水平。结果显示，六君子汤乙酸乙酯部位可降低IL-6、TGF-β1和VEGF的表达，从而抑制Ec9706细胞增殖。

STAT3在组织中分布较广，参与细胞增殖、分化、凋亡、转化、细胞免疫等重要的生理病理过程[10]。STAT3和p-STAT3与肿瘤的进展密切相关。在食管癌组织中，STAT3阳性率明显高于癌旁组织，与组织分化程度呈负相关[12]。STAT3蛋白过度表达及磷酸化可推动食管鳞癌的发生发展及恶性演进[13-15]。IL-6家族的共同受体-gp130参与了STAT3的活化，JENKINS等[15]研究发现，STAT3的缺失突变，基本能完全逆转gp130突变小鼠导致的脾肿大、肝急性相反应、淋巴细胞异常活化及自发的胃窦癌。TGF-β1能够促进HepG2细胞发生EMT，并激活JAK-STAT3通路，而VEGF是STAT3的靶基因[16-18]。本研究结果显示，六君子汤乙酸乙酯部位STAT3、pSTAT3表达水平低于对照组，说明六君子汤乙酸乙酯部位可以降低STAT3活性。

本实验结果显示，六君子汤乙酸乙酯部位作用下的Ec9706细胞表达STAT3和p-STAT3水平均明显降低，说明STAT3的活化被阻断，能有效抑制细胞增殖和促进凋亡，使其不能发挥恶性作用。IL-6、TGF-β1、VEGF含量均降低，说明六君子汤乙酸乙酯部位既能降低STAT3上游分子IL-6、TGF-β1分泌，又能降低STAT3表达和活性，从而降低其下游分子VEGF表达。由此通过干扰STAT3信号通路中相关分子起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。

作者贡献：崔姗姗进行实验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；高小玲、王慧慧、吴耀松、尹素改进行实验实施、评估、资料收集；陈玉龙进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：贾萌萌)

Inhibition of Extract of Liujunzi Decoction on Ec9706 Cells Growth of Esophageal Carcinoma and Its Effects on Signaling Pathway of Signal Transducers and Activations of Transcripition 3

CUIShan-shan，GAOXiao-ling，WANGHui-hui，WUYao-song，YINSu-gai，CHENYu-long.

He′nanUniversityofChineseMedicine，Zhengzhou450046，China

CHENYu-long，He′nanUniversityofChineseMedicine，Zhengzhou450046，China；E-mail：cyl72621@126.com

ObjectiveTo observe the inhibition of extract of Liujunzi decoction on esophageal carcinoma cells Ec9706 growth and the effects on signaling pathway of signal transducers and activations of transcripition 3(STAT3).MethodsFrom 2013 to 2015，Liujunzi decoction was extracted by 70% ethanol，overnight extraction was made by normal butanol，ethyl acetate and water extraction.MTT method was applied to observe the influence of the extracts on the activity of Ec9706 cells.The optimal extracting parts，and enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was used to observe the effects of ethyl acetate extract in Liujunzi decoction on the related cytokines〔including interleukin-6(IL-6)，transforming growth factor-β1(TGF-β1)，vascular endothelial growth factor(VEGF)〕 secreted by Ec9706 cells.Western-blotting method was adopted to test the effects of ethyl acetate extract in Liujunzi decoction on protein expression of esophageal carcinoma cells Ec9706 STAT3 and phosphorylation STAT3(p-STAT3).ResultsThere was significant difference in OD value of Ec9706 cells among the control group，70% ethanol parts，normal butanol parts，and water-extraction parts of Liujunzi decoction(F=448.90，P<0.01).The inhibition effects of Ec9706 cell growth in all medication groups were shown as follows：normal butanol parts of Liujunzi decoction>70% ethanol parts of Liujunzi decoction>water-extraction part of Liujunzi decoction.There was significant difference in OD value of Ec9706 cells in ethyl acetate parts of Liujunzi decoction(F=19.78，P<0.001).When the concentration was 250 μg/ml，the inhibition ratio of 70% ethanol parts，normal butanol parts，and water-extraction parts of Liujunzi decoction on Ec9706 were 7.31%，23.24%，and-25.07% respectively，while the concentration was 200 μg/ml，the inhibition rate of the ethyl acetate extract of Liujunzi decoction on Ec9706 cells was 77.03%，showing a inhibitory effect that was significantly better than the other parts，so the filtered effective part was ethyl acetate fraction of Liujunzi decoction.The inhibition rates IC35，IC50，IC70of ethyl acetate part of Liujunzi decoction calculated by probabilistic method represented low，medium and high concentrations respectively，and the corresponding concentration were 63.08，93.00 and 133.70 μg/ml.There was significant difference in the levels of IL-6，TGF-β1，and VEGF among the control group，low concentration and medium concentration of Liujunzi decoction groups(P<0.01)；the levels of IL-6，TGF-β1，and VEGF in low concentration and medium concentration of Liujunzi decoction groups were lower than those in control group(P<0.05).The expression levels of STAT3 and p-STAT3 in control group and low concentration and medium concentration of Liujunzi decoction groups were significantly different(P<0.05)；the expression levels of STAT3 and p-STAT3 in the low concentrations and medium concentration of Liujunzi decoction groups were lower than those in the control group(P<0.05).ConclusionAmong the extracts of different reagents in Liujunzi decoction，the ethyl acetate extraction has the best inhibitory effect on the proliferation of esophageal carcinoma cells，and the inhibition effect is probably related to the adjusting of STAT3 signaling pathway.

Esophageal neoplasms；Liujunzi decoction；Extracts；Ethyl acetate；STAT3

国家自然科学基金资助项目(81173177)；河南省教育厅自然科学基金资助项目(15B360003)

450046 河南省郑州市，河南中医药大学

陈玉龙，450046 河南省郑州市，河南中医学药大学；E-mail：cyl72621@126.com

R 735.1

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.016

2016-01-03；

2016-06-12)