含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定

索 磊，杨印祥，栾 佐



·论著·

·方法学研究·

含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定

索 磊，杨印祥，栾 佐

目的体外构建含人LINGO-1慢病毒干扰载体，并测定其对靶基因LINGO-1的干扰效应。方法2015年3—11月，根据GenBank数据库中报道的人LINGO-1基因序列，设计合成针对人LINGO-1短发夹RNA(LINGO-1 shRNA)干扰序列，并将其克隆至重组质粒载体，测序验证后在293T细胞内包装慢病毒并测定病毒滴度。将慢病毒载体分为目标基因干扰载体组(实验组)和错配序列干扰载体组(对照组)，并转染至人胶质细胞瘤细胞U251，荧光显微镜下观察其感染效率,并采用免疫荧光染色、实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)法检测LINGO-1 mRNA表达水平，采用Western blotting法检测LINGO-1表达水平。结果成功构建两组慢病毒干扰载体，经过包装分别得到滴度为2×108TU/ml和4×108TU/ml的病毒原液。病毒载体感染人胶质细胞瘤细胞U251后，实验组和对照组载体转染效率分别为96.6%、95.2%。免疫荧光染色显示，人胶质细胞瘤细胞U251高表达LINGO-1，经慢病毒载体转染后，实验组免疫荧光呈现减弱现象。实验组LINGO-1 mRNA表达水平(0.09±0.01)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=12.87，P<0.01)，实验组LINGO-1 mRNA相对表达抑制率为91.0%。实验组LINGO-1表达水平(0.28±0.02)较对照组的(1.00±0.00)降低(t=-8.13,P<0.01)。结论本研究成功构建了含人LINGO-1 shRNA干扰载体，并证实了干扰载体对靶基因有较好的干扰效果，为研究LINGO-1在轴突再生中的作用奠定了基础。

慢病毒属；RNA干扰；LINGO-1

索磊，杨印祥，栾佐.含人LINGO-1慢病毒干扰载体的构建与鉴定[J].中国全科医学，2016，19(24)：2962-2966.[www.chinagp.net]

SUO L,YANG Y X,LUAN Z.Construction and identification of lentiviral interference vector that including human LINGO-1[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2962-2966.

中枢神经系统损伤后如何有效地促进神经元的轴突再生、突触形成，已经成为当前神经再生领域研究的热点，近年来研究发现，LINGO-1在多种中枢神经系统损伤动物模型中表达明显升高，其可能在神经再生过程中发挥了重要的负调控作用[1-2]；而RNA干扰(RNA inference,RNAi) 作为一种新兴基因治疗手段,能够特异性抑制目的基因的表达，为进一步研究LINGO-1在调控神经元增殖和分化的发生、发展中的功能机制提供了新的研究方法[3-4]。国内关于LINGO-1基因的研究主要集中在动物源细胞实验研究[5]。本实验设计构建了针对人LINGO-1短发夹RNA(LINGO-1 shRNA)的慢病毒载体，并检测其对人胶质细胞瘤细胞U251 LINGO-1基因的干扰效率，为后续探究人LINGO-1拮抗性实验研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1主要材料人胶质细胞瘤细胞U251、慢病毒干扰载体〔pGCSIL-绿色荧光蛋白(GFP)质粒〕及慢病毒包装系统均由北京溯源精微科技有限公司提供；其他主要实验材料包括质粒抽提试剂盒(Omega公司)，AgeⅠ、EcoRⅠ内切酶及T4 DNA连接酶(NEB公司)，琼脂糖(上海赛百盛基因技术有限公司)，DMEM培养基及高糖DMEM培养基(Gibco公司)，β甘油磷酸钠、二磷酸维生素C、地塞米松(Sigma公司)，胎牛血清(HyCione公司)，Trizol试剂(Invitrogen公司)，反转录试剂盒、聚合酶链式反应(PCR)试剂盒(Sigma公司)及LINGO-1一抗和二抗(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1细胞的培养2015年3—11月，人胶质细胞瘤细胞U251使用含10%胎牛血清(FBS)的高糖DMEM培养基，在37 ℃、5% CO2及饱和湿度的条件下培养，贴壁生长，3～4 d传代一次。

1.2.2含人LINGO-1 shRNA慢病毒载体构建根据GenBank数据库中报道的人LINGO-1基因序列(NM_001301186.1)，设计、合成LINGO-1 shRNA序列以及无靶向随机打散序列(LINGO-ctl)，LINGO-1上游引物为5′-CCGGGCAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTCGAGGGAAGTCCTT

GAACTCCTTGCTTTTTG-3′，下游引物为5′-AATTCAAAAAG

CAAGGAGTTCAAGGACTTCCCTCGAGGGAAGTCCTTGAACTCC

TTGC-3′；LINGO-ctl上游引物为5′-CCGGGCGAGAAGTT

CATCGTTATCCCTCGAGGGATAACGATGAACTTCTCGCTTTTTG

-3′，下游引物为5′-AATTCAAAAAGCGAGAAGTTCATCGTT

ATCCCTCGAGGGATAACGATGAACTTCTCGC-3′。采用限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ对两对载体框架及慢病毒载体pGCSIL-GFP进行双酶切(37 ℃，过夜),酶切后将干扰载体框架与干扰载体进行连接(16 ℃，过夜),形成重组干扰载体pGCSIL-GFP-LINGO-1。

1.2.3重组干扰载体的转化、PCR鉴定及测序取2 μl连接产物加入200 μl大肠埃希菌感受态细胞DH5a，冰浴30 min，42 ℃水浴90 s，快速冰浴2 min，加入800 μl SOC培养液混匀，37 ℃摇床振荡培养45 min，取150 μl已转化的大肠埃希菌感受态细胞DH5a，均匀涂布于含氨苄霉素(Amp)抗性(100 μg/ml)的LB琼脂培养平板，37 ℃培养16 h。然后进行阳性克隆的PCR鉴定,挑选阳性单克隆菌液送公司测序(上海美季生物技术有限公司进行ABI3733型测序仪测序分析)。

1.2.4病毒包装及病毒滴度测定将转染混合物(稀释后的DNA与转染试剂混合)滴加到293T细胞培养液中，摇匀，于细胞培养箱中培养。转染后24 h，采用荧光显微镜观察含标签荧光(GFP/RFP)细胞的数量，判定转染效率，确定转染成功后(GFP荧光细胞比例≥90.0%)，进行收毒操作，收集含重组慢病毒的细胞上清液，过滤、浓缩，置-80 ℃保存备用。采用逐孔倍比稀释法(10倍)，将病毒原液感染293T细胞后,进行病毒滴度测定。细胞转染72 h后在荧光显微镜下观察含有目的病毒标记的细胞数(GFP)，计数病毒滴度。

1.2.5慢病毒载体对LINGO-1基因表达干扰效率的检测人胶质细胞瘤细胞U251接种于48孔板中，2×104个细胞/孔，接种24 h后进行慢病毒转染；实验分为两组：目标基因干扰载体组(实验组)和错配序列干扰载体组(对照组)；转染用重组病毒液感染复数(MOI)为100。转染后12 h更换培养基,继续培养。转染3 d后应用荧光显微镜测定各组细胞的载体转染效率,载体转染效率(%)=(GFP阳性细胞数/所测细胞总数)×100%；若GFP阳性细胞数比例大于95.0%，则继续培养3 d后，收集细胞分别行免疫荧光染色、实时荧光定量PCR(qPCR)、Western blotting法检测。

1.2.6qPCR法检测LINGO-1 mRNA表达水平收集人胶质细胞瘤细胞U251转入无RNA酶的PCR管中，加入1 ml Trizol试剂，冰上反应5 min后置于-80 ℃冰箱备用；经RNA反转录得到cDNA，SYBRGreenⅠ法进行qPCR。LINGO-1上游引物为5′-TCTCCTACAACCCCATCAGC-3′，下游引物为5′-TTGCCAGAGACATTGAGCAC-3′；hACTB上游引物为5′-TGCGCAGAAAACAAGATGAG-3′，下游引物为5′-CACCTTCACCGTTCCAGTTT-3′；PCR反应条件： 95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，55 ℃复性15 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；75 ℃退火10 min。置于4 ℃保存备用。扩增产物上样电泳，凝胶成像系统对条带进行扫描分析。采用2-ΔΔCt方法分析基因相对表达量。实验重复3次。

1.2.7Western blotting法检测LINGO-1表达水平贴壁人胶质细胞瘤细胞U251，洗涤后，加入适量RIPA裂解液(约细胞体积6倍)，裂解5～10 min，转至1.5 ml EP中，孵育1.5 h充分裂解后，12 000×g离心10 min，取上清液，即为蛋白提取物。各组样品，取上清液测定并记录蛋白浓度后置于-80 ℃冰箱冻存。定量蛋白样品采用10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳，100 V电压转膜。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加Anti-LINGO-1一抗(1∶1 000)4 ℃孵育12 h后，辣根过氧化物酶(HRP)标记的对应二抗(1∶5 000)室温孵育2 h，ECL发光显影，定影。运用Image J软件分析目的条带灰度值(β-actin标准内参对照)，计算LINGO-1相对值表达量。实验重复3次。

2　结果

2.1重组干扰载体的转化、PCR鉴定及测序重组干扰载体转化大肠埃希菌感受态细胞DH5a后,阳性克隆PCR扩增,其产物经琼脂糖凝胶电泳测定,表达特异性条带 (见图1)。上述结果说明,合成的干扰载体框架被成功连接到慢病毒载体中。质粒测序结果表明,重组载体序列与合成的干扰载体框架完全一致(见图2，本文彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件),可进一步说明重组干扰载体构建是成功的。

注：shRNA=短发夹RNA

图1重组干扰载体的PCR鉴定

Figure 1PCR identification of recombinant virus vectors

图2　LINGO-1-shRNA质粒测序结果

2.2病毒包装及病毒滴度测定质粒载体转染293T细胞24 h后，荧光显微镜下观察含标签荧光(GFP/RFP)细胞的数量，经计算转染效率高达95.0%以上(见图3)。收集病毒原液后,经逐孔稀释法滴度测定,重组慢病毒均获得了较高的滴度,分别为2×108TU/ml和4×108TU/ml，符合后续实验要求。

2.3人胶质细胞瘤细胞U251病毒载体感染及干扰效率目标基因干扰载体和错配序列干扰载体转染人胶质细胞瘤细胞U251后(MOI值100)，24 h后镜下GFP呈弱阳性，转染第3天后GFP呈强阳性(见图4)。实验组和对照组载体转染效率分别为96.6%、95.2%。

2.4免疫荧光染色LINGO-1表达情况免疫荧光染色显示，人胶质细胞瘤细胞U251高表达LINGO-1，经干扰载体转染干扰后，实验组免疫荧光呈现减弱现象，可间接表明实验组LINGO-1表达量较对照组有所减少(见图5)。

2.5qPCR法检测LINGO-1 mRNA表达水平实验组LINGO-1 mRNA表达水平为(0.09±0.01)，对照组为(1.00±0.00)，差异有统计学意义(t=12.87，P<0.01)。实验组LINGO-1 mRNA相对表达抑制率为91.0%。

2.6Western boltting法检测LINGO-1表达水平实验组LINGO-1表达水平为(0.28±0.02)，对照组为(1.00±0.00)，差异有统计学意义(t=-8.13，P<0.01，见图6)。

注：A、C为明场293细胞，B、D为带GFP荧光细胞

图3质粒转染效率(×100)

Figure 3Transfection efficiency of plasmid

注：A：实验组GFP病毒感染，B：实验组4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染核，C：实验组Merge图，D：对照组GFP病毒感染，E：对照组DAPI染核，F：对照组Merge图

图4人胶质细胞瘤细胞U251病毒载体感染(×200)

Figure 4Lentiviral vectors transfected into in U251 cells of human glioma

注：A：实验组LINGO-1荧光染色，B：实验组DAPI染核，C：实验组Merge图，D：对照组LINGO-1荧光染色，E：对照组DAPI染核，F：对照组Merge图

图5LINGO-1免疫荧光染色(×200)

Figure 5LINGO-1 immunofluorescence staining

图6　Western boltting法检测LINGO-1表达水平电泳图

Figure 6Electrophoretogram of expression level of LINGO-1 protein by Western blotting method

3　讨论

中枢神经系统损伤性疾病包括缺氧缺血性脑病、创伤性脑损伤、脊髓损伤、运动神经元疾病等，是一类严重威胁人类健康的疾病。中枢神经系统损伤导致神经元永久性死亡、轴突崩解及髓鞘脱失，而神经系统的自我修复过程又十分复杂，其中中枢神经生长微环境是影响神经元、轴突再生的一个关键因素[6]。因此，近年来从神经再生微环境着手，如何有效促进中枢神经系统损伤神经的再生，寻找促进轴突再生的有效靶点成为研究的新方向[7]。研究者现已发现，多种神经再生抑制性因子在神经再生过程中发挥着重要的作用[8]；而LINGO-1就是其中一个典型代表，LINGO-1是一个由614个氨基酸组成的跨膜蛋白，早期研究发现LINGO-1可以抑制轴突生长[9]；近年来动物实验研究表明，LINGO-1在神经元轴突的髓鞘化过程中也发挥了重要的调控作用[10-12]，LINGO-1是成髓鞘细胞分化和髓鞘化的一个关键的负调节因素[13]。因此，若人源细胞中LINGO-1表达下调也可能会对中枢神经再生产生重要的影响作用。

慢病毒载体主要是由人类免疫缺陷型病毒(human immunodeficiency virus,HIV)发展改造而来，其对感染靶细胞的细胞周期要求低，感染靶细胞后不但可以长期稳定表达，而且不会产生生物危害。一般根据实验需要对慢病毒载体进行改造，通过慢病毒介导的RNAi进行肿瘤疾病、神经系统疾病的研究[14-15]；RNAi作为一种新兴基因治疗手段,能够特异性抑制目的基因的表达效果[3-4]。

本研究根据LINGO-1基因的特异性,通过慢病毒干扰载体降低人源U251细胞LINGO-1的表达。采用分子生物学技术，应用慢病毒作为RNAi的载体,通过基因重组技术构建了人LINGO-1基因重组慢病毒干扰载体,重组载体经转化、PCR鉴定及DNA测序，证实插入序列与设计的shRNA寡聚核苷酸序列完全一致，证明成功构建重组载体，进一步包装后，获得了高纯度的病毒原液；且LINGO-1 RNAi载体带有绿色荧光蛋白基因，便于慢病毒包装时转染效率的测定及对靶细胞U251感染效率的评估，实验结果显示，质粒转染效率均在95.0%以上。慢病毒感染U251细胞3 d后，荧光显微镜下观察发现，实验组和对照组细胞内均可见大量绿色荧光，经计算GFP阳性细胞数分别为96.6%和95.2%，初步判定感染靶细胞成功。为验证所构建的干扰载体对U251细胞中LINGO-1基因表达的干扰效果，分别运用免疫荧光染色、qPCR和Western blotting法进行了检测。在qPCR检测中，采用了相对定量比较CT值法，计算结果得出实验组LINGO-1 mRNA表达水平明显低于对照组，基因沉默效率高达91.0%。Western blotting法检测LINGO-1表达水平，结果显示，实验组LINGO-1表达水平明显低于对照组；免疫荧光染色间接证明实验组LINGO-1表达有所减少。

综上所述，本实验成功构建含人LINGO-1慢病毒干扰载体对人源靶基因LINGO-1表达具有显著的抑制作用，为LINGO-1的拮抗性相关性实验研究以及探究LINGO-1在神经再生中的作用奠定了实验基础。但是鉴于神经轴突再生微环境的极其复杂，受多重因素的影响；通过RNAi来降低人源细胞LINGO-1的表达，能否促进神经轴突的再生以及对LINGO-1相关信号转导通路是否产生影响，均需要进一步探究。

作者贡献：杨印祥、栾佐进行实验设计；索磊进行实验实施、评估、资料收集以及论文撰写；栾佐进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：陈素芳)

Construction and Identification of Lentiviral Interference Vector That Including Human LINGO-1

SUOLei,YANGYin-xiang,LUANZuo.

TheThirdClinicalCollegeofMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China

LUANZuo，theThirdClinicalCollegeofMedicine,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515；DepartmentofPediatrics，NAVYGeneralHospital,Beijing100048,China；E-mail:luanzuo2009@163.com

ObjectiveTo construct the lentiviral interference vector that including human LINGO-1 in vitro and evaluate its interference effects on the target gene LINGO-1.MethodsFrom March to November in 2015,interference sequences that targeted at human LINGO-1 interfered by short hairpin RNA (LINGO-1 shRNA) were designed and synthesized according to the LINGO-1 gene sequence reported in GenBank database,LINGO-1 shRNA was cloned into recombinant plasmid vectors.They were assembled in 293T cells after sequence verification.The test divided into interference vector group of target gene (experimental group) and interference vector group of mismatch sequence (control group),the lentiviral vectors were transfected into U251 cells of human glioma,and its efficiency of infection was observed by fluorescence microscopy.Immunofluorescent staining and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (qPCR) method were adopted to detect the expression level of LINGO-1 mRNA.The expression level of LINGO-1 was detected by Western blotting method.ResultsTwo groups of lentiviral interference vectors were successfully constructed,and the virus stock solutions with a titer of 2×108TU/ml and 4×108TU/ml were obtained respectively after package.After U251 cells of human glioma were transfected with virus vectors,the transfection efficiency of vectors in experimental group and control group were 96.6% and 95.2% respectively.Immunofluorescent staining presented that LINGO-1 was highly expressed in U251 cells of human glioma,and immunofluorescence in experimental group weakened after the transfection of lentiviral vectors.The expression level of LINGO-1 mRNA in experimental group (0.09±0.01) was significantly decreased compared with that in control group (1.00±0.00) (t=12.87，P<0.01),and the interference rate of LINGO-1 mRNA relative expression in experimental group was 91.0%.Compared with control group (1.00±0.00),the LINGO-1 expression level of experimental group (0.28±0.02) was significantly decreased (t=-8.13,P<0.01).ConclusionThe paper has successfully constructed lentiviral shRNA interference vectors that targeting at human LINGO-1,and verified there are good inference effects of interference vectors on target genes,which provides basis for studying the role of LINGO-1 in axon regeneration.

Lentivirus；RNA interference；LINGO-1

国家自然科学基金面上项目(81471486)

510515广东省广州市，南方医科大学第三临床医学院(索磊，栾佐)；中国人民解放军海军总医院儿科(杨印祥，栾佐)

栾佐,510515广东省广州市，南方医科大学第三临床医学院，中国人民解放军海军总医院儿科；

E-mail:luanzuo2009@163.com

R 349.65

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.019

2016-01-02；

2016-06-25)