核转录因子κB p65和骨桥蛋白在子宫内膜异位症中的表达及相关性研究

2016-08-25 02:31白治苗李望舒姚卫卫卢玉凤哈春芳
中国全科医学 2016年24期
关键词:骨桥蛋白胞质异位症

白治苗,李望舒,姚卫卫,卢玉凤,杨 眉,哈春芳



·论著·

·专题研究·

核转录因子κB p65和骨桥蛋白在子宫内膜异位症中的表达及相关性研究

白治苗,李望舒,姚卫卫,卢玉凤,杨 眉,哈春芳

背景目前子宫内膜异位症(EMs)的病因和发病机制尚不清楚,治疗措施有限,严重影响女性的身心健康。目的探讨核转录因子κB(NF-κB)p65和骨桥蛋白(OPN)在EMs组织中的表达及二者的相关性。方法收集2013年1—12月于宁夏医科大学总医院妇产科因EMs行手术的患者35例(病例组),于术中或术后确诊,其中增生期17例,分泌期18例;收集同期行双侧输卵管结扎手术并经病理科诊断排除EMs的正常子宫内膜者30例作为对照(正常子宫内膜组),其中增生期15例,分泌期15例。分别采用免疫组化SP法、RT-PCR法检测正常子宫内膜组、EMs在位内膜组和EMs异位内膜组NF-κB p65、OPN及其mRNA的表达。结果NF-κB p65、OPN主要表达于子宫内膜腺上皮细胞的胞质中,极少数表达于间质细胞中。EMs在位、异位内膜组NF-κB p65和OPN表达高于正常子宫内膜组,EMs异位内膜组高于EMs在位内膜组(P<0.05)。3组增生期及分泌期NF-κB p65的表达比较,差异无统计学意义(P>0.05),EMs在位、异位内膜组分泌期OPN的表达均高于增生期(P<0.05);EMs在位内膜组和EMs异位内膜组中NF-κB 与OPN的表达均呈正相关(r在位=0.88,r异位=0.78,P<0.05)。NF-κB p65、OPN mRNA在EMs在位、异位内膜组中的表达高于正常子宫内膜组,EMs异位内膜组高于EMs在位内膜组(P<0.05)。结论NF-κB p65、OPN及其mRNA在EMs患者在位、异位内膜组织的表达明显增强,并呈正相关,提示二者极有可能通过相互激活进而诱导EMs的发生、发展。

子宫内膜异位症;核因子κB;骨桥蛋白质

白治苗,李望舒,姚卫卫,等.核转录因子κB p65 和骨桥蛋白在子宫内膜异位症中的表达及相关性研究[J].中国全科医学,2016,19(24):2915-2919.[www.chinagp.net]

BAI Z M,LI W S,YAO W W,et al.Expression of NF-κB p65 and OPN in endometriosis and their correlations research[J].Chinese General Practice,2016,19(24):2915-2919.

子宫内膜异位症(EMs)是指子宫内膜移位到宫腔以外的任何部位,尤以卵巢最为常见;是引起下腹坠胀痛、月经失调、性交痛以及不孕的常见病因[1]。目前该病的病因与发病机制尚不清楚,治疗措施有限,临床上主要以手术治疗为主,但术后复发、术中病灶清除不干净等使患者的预后欠佳,因此药物治疗在EMs患者的术后恢复中发挥重要作用[2]。EMs在病理上呈现为良性疾病,却有着类似恶性肿瘤的侵袭、种植及远处转移等生物学行为。随着对EMs研究的不断深入,有研究发现EMs的发生极有可能与细胞的异常增殖、凋亡的抑制活动有关联[3]。核转录因子κB(NF-κB)是细胞内重要的核转录因子之一,可促进细胞因子、黏附分子、生长因子、环氧化酶-2、基质金属蛋白酶等表达,参与启动并调节机体免疫和炎性反应、细胞的凋亡及增殖分化[4]。骨桥蛋白(OPN)是细胞信息传导通路中一种由多种细胞表达和分泌的磷酸糖蛋白,有研究表明OPN与其受体结合后参与细胞黏附、趋化、应激依赖的血管新生、凋亡的阻抑活动,诱导EMs的发生[5]。本课题组前期实验已经证实OPN在大鼠模型的在位内膜、异位内膜中呈高表达,且与EMs的发生、发展密切相关[6]。本实验通过免疫组化SP法、RT-PCR法分别检测NF-κB p65、OPN及其mRNA在正常子宫内膜、EMs在位内膜以及异位内膜中的表达;并分析两者之间的相关性,以推测两者在EMs发病机制中的可能作用。

1 资料与方法

1.1病例纳入标准病例组和正常子宫内膜组前次月经周期均正常,病例组术中或术后经病理科证实为EMs,近3个月均未接受过激素类药物治疗,无子宫息肉、子宫内膜非典型性增生、生殖道炎症等妇科器质性疾病。患者年龄20~45岁。

1.2病例组收集2013年1—12月于宁夏医科大学总医院妇产科因EMs行手术,术中或术后确诊的患者35例,其中增生期17例,分泌期18例。病例组按照组织获取部位分为EMs在位内膜组和EMs异位内膜组。

1.3正常子宫内膜组收集同期行双侧输卵管结扎手术并经病理科诊断排除EMs的30例正常子宫内膜作为对照,增生期、分泌期各15例。

1.4主要试剂免疫组化SP法:兔抗人NF-κB p65、OPN多克隆抗体均购自美国Abcam生物公司(稀释浓度分别为1∶100、1∶80),DAB显色试剂盒、PV-6001试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。NF-κB p65、OPN引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;RT-PCR法:cDNA反转录核、免疫荧光定量试剂盒均购自美国Thermo公司。

1.5实验方法

1.5.1免疫组化SP法组织由病理科证实为EMs后于40%甲醛溶液中浸泡过夜,10%甲醛溶液固定,程序脱水、石蜡包埋,3~4 μm厚度连续切片,在65 ℃烤箱过夜,经过脱蜡、抗原修复、一抗孵育过夜、二抗孵育2 h,DAB显色、梯度乙醉脱水、二甲苯透明等步骤后用中性树胶封固,以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.5.2RT-PCR法步骤根据引物设计原则并参照人类NF-κB p65、OPN基因排序,采用引物设计软件 Primer Premier 5 设计,NF-κB p65上游引物为:TCAATGGCTACACAGGACCA,下游引物为:CACTGTCACCTGGAAGCAGA,OPN上游引物为:AGACCTGACATCCAGTACCCTG,下游引物为:GTGGGTTTCAGCACTCTGGT。RNA 提取:称取约50 mg内膜组织置于匀浆器中加入 1 ml Trizzol后充分匀浆,将裂解液移入1.5 ml EP 管,4 ℃,12 000 r/min(离心半径5.5 cm)离心10 min,取上层裂解液加入0.2 ml四氯化碳,冰浴5 min,再次离心后取上层水相加0.5 ml异丙醇,颠倒混匀后冰浴10 min,离心去除上清液,加入1 ml 75%乙醇溶液,4 ℃,7 500 r/min(离心半径5.5 cm)离心5 min,弃去上清液,RNA自然干燥10 min。RNA 定量:用20 μl无RNA 酶的水溶解RNA,取 2 μl采用750紫外分光光度计测量OD260/OD280确定 RNA 的完整性与纯度。反应条件:94 ℃ 预变性 3 min,1个循环,94 ℃ 变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,35个循环,72 ℃终反应5 min。

1.6结果判定标准(1)采用OLYMPUS.BX51显微镜观察结果,以胞质中出现黄色或棕黄色颗粒为阳性表达。采用Image-Pro Plus 6.0专业图像分析软件对阳性结果进行半定量分析并计算平均积分光密度值(IOD)。(2)BIO-RAD凝胶扫描系统分析摄像,用Roche-Lightcycler 96对产物进行半定量分析,以2-ΔΔCt表示NF-κB p65、OPN mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1NF-κB p65主要表达于子宫内膜腺上皮细胞的胞质中,胞核中有少量表达,极少数表达于子宫内膜间质细胞;OPN主要表达于子宫内膜腺上皮细胞的胞质中,少数表达于子宫内膜间质细胞中(见图1,本文图1彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

2.2EMs在位、异位内膜组NF-κB p65和OPN的表达均高于正常子宫内膜组,EMs异位内膜组的表达高于EMs在位内膜组,差异均有统计学意义(P<0.05,见表1)。3组增生期及分泌期NF-κB p65的表达比较,差异无统计学意义(P>0.05),EMs在位、异位内膜组分泌期OPN的表达高于增生期,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

2.3EMs在位、异位内膜组中NF-κB p65与OPN的表达呈正相关(r在位=0.88,P<0.05;r异位=0.78,P<0.05,见图2)。

2.4NF-κB p65、OPN mRNA在EMs在位内膜组、EMs异位内膜组中的表达高于正常子宫内膜组,EMs异位内膜组高于EMs在位内膜组,差异均有统计学意义(P<0.05,见表3)。

注:A、B、C分别是核转录因子κB(NF-κB)p65在正常子宫内膜组、子宫内膜异位症(EMs)在位内膜组、EMs异位内膜组的表达;D、E、F分别是骨桥蛋白(OPN)在正常子宫内膜组、EMs在位内膜组、EMs异位内膜组的表达

图13组内膜NF-κB p65及OPN的表达(免疫组化SP法,×400)

Figure 1Expression of NF-κB p65 and OPN in endometrium among three groups

Table 1Comparison of the expression of NF-κB p65 and OPN protein in endometrium among the three groups

组别例数NF-κBp65OPN正常子宫内膜组300.154±0.0740.128±0.047EMs在位内膜组350.460±0.089a0.697±0.089aEMs异位内膜组350.771±0.155ab0.877±0.146abF值240.180444.010P值<0.001<0.001

注:与正常子宫内膜组比较,aP<0.05;与EMs在位内膜组比较,bP<0.05;EMs=子宫内膜异位症,NF-κB=核转录因子κB;OPN=骨桥蛋白

3 讨论

本研究通过实验方法分别检测NF-κB p65、OPN及其mRNA在正常子宫内膜、EMs在位及异位内膜组织中的表达,并分析二者之间的关系,以期进一步揭示两者在诱导该病发生过程中发挥的作用。

表2 3组增生期和分泌期NF-κB p65及OPN表达的比较

图2 EMs在位内膜组、EMs异位内膜组NF-κB p65与OPN表达的相关性

Table 3Comparison of the expression of NF-κB p65 mRNA and OPN mRNA among the three groups

组别例数NF-κBp65mRNAOPNmRNA正常子宫内膜组351.321±0.1010.351±0.282EMs在位内膜组353.438±0.285a2.851±0.252aEMs异位内膜组353.742±0.350ab3.012±0.261abF值853.651107.01P值<0.001<0.001

注:与正常子宫内膜组比较,aP<0.05;与EMs在位内膜组比较,bP<0.05

3.1NF-κB p65与EMs目前,NF-κB p65在医学各领域中备受瞩目,属于Rel家族中的一个因子,含有转录活化区域,可直接刺激转录设备而激活转录过程,还可抑制细胞凋亡,促进细胞增殖及多种炎性因子的激活[7]。人体中NF-κB存在于胞质中,受到异常刺激后激活MAPK、PI 3-K/AKt通路,进入细胞核中与多种细胞基因启动子或增强子序列特定位点结合,参与相关基因的转录调控及细胞凋亡的调控。已有研究证明NF-κB在多种恶性肿瘤如宫颈癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等的细胞增殖,抗凋亡、促血管生成及转移过程中发挥重要作用[8-9]。但 NF-κB通路在EMs的研究甚少,国内孙群燕[10]用子宫内膜移植法建立NF-κB p50基因敲除小鼠EMs动物模型,建模后通过免疫组化检测发现NF-κB在异位内膜、在位内膜以及阴道中的表达明显下降,与观察到的异位病灶变小的结果相吻合,揭示了NF-κB通路在EMs的发病机制中可能发挥作用。本实验通过免疫组化SP法、RT-PCR法检测NF-κB p65及其mRNA在EMs中的表达,发现NF-κB p65在EMs在位、异位内膜组中的表达明显高于正常子宫内膜组,且主要定位于子宫内膜的腺上皮细胞胞质中,极少数表达于间质细胞中,且其在月经周期中的表达与月经周期无关,进一步从蛋白、基因水平证实其与EMs的发病机制可能密切相关。

3.2OPN与EMsOPN是细胞信息传导通路中一种重要的磷酸化基质蛋白,含有特异的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Glu-Asp,RGD) 序列,这一序列与许多细胞外基质蛋白的黏附序列相同,通过酶切后与其受体整合素avβ3和CD44结合,使多种激酶( PI 3-K、NIK、PLC、PKC 和MAPK) 磷酸化激活,介导细胞侵袭过程、细胞外基质的降解和重塑、细胞迁移、宿主免疫细胞的逃逸和新生血管的形成。国外学者利用OPN基因剔除大鼠及OPN抗体抑制剂研究OPN在EMs中的作用,结果显示OPN与EMs病灶的大小、体积及数目密切相关[11]。课题组前期实验也已经证实OPN在大鼠EMs模型中呈高表达且与EMs患者在位内膜腺上皮细胞的侵袭性密切相关[5,12]。本课题分别通过免疫组化SP法、RT-PCR法等实验方法检测OPN及其mRNA在EMs患者中的表达发现,OPN及其mRNA在EMs异位内膜组中的表达高于EMs在位内膜组和正常子宫内膜组中的表达,且主要表达于内膜腺上皮细胞胞质中;除此之外,发现OPN在分泌期中的表达明显高于增生期,说明其与孕酮在体内增高有内在的联系,与临床上使用激素类药物治疗EMs的机制相吻合,进一步验证了OPN可能是导致EMs发生的关键因子。

3.4NF-κB p65与OPN在EMs中的关系有研究表明OPN与其受体avβ3或CD44结合后可使与NF-κB结合的抑制剂IkB磷酸化,促使NF-κB p65-50二聚体从胞质进入胞核,调控细胞因子的转录及促进尿激酶型纤溶酶原激活物的表达,加快了细胞外基质及基底膜的降解步伐,为异位内膜的黏附、种植、生长提供了有利条件[13-14]。本实验结果也表明NF-κB p65与OPN在EMs在位、异位内膜组中的表达呈正相关,与上述研究观点基本相符,进一步说明两者在EMs的发病机制中相辅相成共同诱导其发生。由此推测,OPN与其受体结合后可能通过激活NF-κB通路而导致EMs。

本课题组期望今后通过特异性OPN siRNA干扰EMs患者在位内膜腺上皮细胞后经Western blotting法、RT-PCR法及Transwell等方法检测NF-κB p65、OPN及其mRNA的变化进一步证实二者在EMs发病机制中的作用及相关性,为EMs的病因研究提供一种新的思路,为其药物靶向治疗提供一种更可靠的依据。

作者贡献:白治苗、李望舒负责收集病例并完成相关实验部分,撰写论文、成文并对文章负责。姚卫卫进行相关知情同意书资料、处理、收集整理;卢玉凤进行相关的文献查阅;杨眉对相关查阅的文献进行翻译、分析,提供可靠的数据;哈春芳进行质量控制。

本文无利益冲突。

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(本文编辑:赵跃翠)

Expression of NF-κB p65 and OPN in Endometriosis and Their Correlations Research

BAIZhi-miao,LIWang-shu,YAOWei-wei,LUYu-feng,YANGMei,HAChun-fang.

DepartmentofObstetricsandGynecology,theSecondHospitalofYulin,Yulin719000;NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

HAChun-fang,DepartmentofGynecology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity;KeyLaboratoryofFertilityPreservationandMaintenanceoftheMinistryofEducation,Yinchuan750004,China;E-mail:hachunfang@163.com

BackgroundThe etiology and pathogenesis of endometriosis (EMs) is still unclear with limited therapeutic measures,which seriously influence the physical and mental health of women.ObjectiveTo investigate the expression of NF-κB p65 and osteopontin (OPN) in EMs tissues and their correlations.Methods35 patients with EMs,who had been implemented operation in Department of Gynaecology and Obstetrics in General Hospital of Ningxia Medical University from January to December 2013,were selected as the case group,of which 17 are in proliferative phase and 18 in secretory phase;30 cases with normal endometrium,who had taken contraceptive operation at the same period and were diagnosed without EMs,were enrolled as a comparison (normal endometrium group),15 cases are in proliferative phase and 15 in secretory phase.Immunohistochemistry SP method and RT-PCR were applied to detect the expression of NF-κB p65,OPN and their mRNA in normal endometrium group,eutopic endometrium and ectopic endometrium groups respectively.ResultsNF-κB p65 and OPN were mainly expressed in the cytoplasm of endometrial glandular epithelial cells and few were expressed in stromal cells.The expression of NF-κB p65 and OPN in EMs eutopic and ectopic endometrium groups of EMs eutopic and ectopic endometrium groups were higher than that in normal endometrium group,their expression in EMs ectopic endometrium groups was higher than that in EMs eutopic endometrium group (P<0.05).There was no significant difference in the expression of NF-κB p65 proteins in proliferative phase and secretory phase within the three groups (P>0.05),the expression of OPN in secretory phase of EMs eutopic and ectopic endometrium groups were higher than that in proliferative phase (P<0.05);the expression of NF-κB p65 and OPN showed a positive correlation in EMs eutopic and EMs ectopic endometrium groups (rb=0.88 andrc=0.78,P<0.05).The relative expression of NF-κB p65,OPN mRNA in EMs eutopic and EMs ectopic endometrium groups was higher than that in normal endometrium group,and their expression in EMs ectopic endometrium group was higher than that in EMs eutopic endometrium group (P<0.05).ConclusionThe expression of NF-κB p65,OPN and their mRNA in eutopic and ectopic endometrial tissues increases obviously and they are positively correlated with each other,which indicates that the mutual activation of them may induce the occurrence and development of EMs.

Endometriosis;NF-kappa B;Osteopontin

国家自然科学基金资助项目(81160078);2015生殖与遗传基础及临床研究创新团队开放课题(220/2002080102)

719000陕西省榆林市第二医院妇产科(白治苗);宁夏医科大学(白治苗,李望舒,姚卫卫,卢玉凤,杨眉);湖北省襄阳市中心医院 湖北文理学院附属医院妇产科(杨眉);宁夏医科大学总医院妇科,生育力保持重点实验室(哈春芳)

哈春芳,750004宁夏银川市,宁夏医科大学总医院妇科,生育力保持重点实验室;E-mail:hachunfang@163.com

R 711.71

ADOI:10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.009

(投稿日期:2016-04-10;2016-07-10)

【编者按】子宫内膜异位症可发生于所有育龄期女性,据统计,子宫内膜异位症在妇科剖宫产手术患者中占15%~30%,在腹腔镜绝育手术中占2%~43%,在不孕症患者中占20%~40%,且近年来其发病率呈逐年增长的趋势,然而发病机制尚不清楚且临床治疗措施有限,患者手术治疗后仍存在复发、疼痛、预后欠佳等不良现象。因此,进一步探究子宫内膜异位症的发生发展机制以寻求更安全、高效的临床治疗方法。为此,本期特邀宁夏医科大学总医院妇科主任哈春芳教授组织了有关子宫内膜异位症方面的“专题研究”,从分子水平探讨子宫内膜异位症的发生发展机制,得出核转录因子κB p65、骨桥蛋白、基质金属蛋白酶9在子宫内膜异位症患者中表达异常,为推动子宫内膜异位症的病因治疗提供参考。

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