糖尿病及他汀类药物治疗对稳定型心绞痛患者循环微小RNA-92a表达的影响研究

王 虹，林英忠，龚国平，马春兰，伍崇信



·论著·

糖尿病及他汀类药物治疗对稳定型心绞痛患者循环微小RNA-92a表达的影响研究

王 虹，林英忠，龚国平，马春兰，伍崇信

目的探讨稳定型心绞痛(SAP)患者循环微小RNA(miR)-92a表达水平与糖尿病及他汀类药物治疗的关系。方法选取2010年3月—2011年3月在广西壮族自治区人民医院心内科住院的SAP患者116例，其中合并糖尿病者30例，接受他汀类药物治疗者46例。采用RT-qPCR检测患者循环miR-92a表达水平。比较是否合并糖尿病及他汀类药物治疗对SAP患者循环miR-92a表达水平的影响；以及是否接受他汀类药物治疗对老年SAP患者循环miR-92a表达水平的影响。结果SAP患者循环miR-92a表达水平为(0.53±0.44)，Pearson相关分析结果显示，SAP患者年龄与循环miR-92a表达水平呈正相关(r=0.217，P=0.019)。以循环miR-92a为因变量，年龄为协变量，协方差分析结果显示，糖尿病与年龄对循环miR-92a表达水平的影响存在交互作用(F=19.631，P<0.05)；他汀类药物治疗与年龄对循环miR-92a表达水平的影响存在交互作用(F=2.346，P<0.05)。多因素方差分析结果显示，老年合并糖尿病接受他汀类药物治疗的SAP患者循环miR-92a表达水平低于未接受他汀类药物治疗的SAP患者(F=22.080，P=0.001)；老年未合并糖尿病的SAP患者，是否接受他汀类药物治疗者循环miR-92a表达水平比较，差异无统计学意义(F<0.001，P=0.992)。结论糖尿病及他汀类药物治疗对SAP患者循环miR-92a表达水平存在影响，且他汀类药物治疗使老年合并糖尿病SAP患者循环miR-92a表达水平降低，提示他汀类药物可能通过调控循环miR-92a表达水平进而起到改善内皮功能的作用。

心绞痛，稳定型；老年人；糖尿病；他汀；微RNAs

王虹，林英忠，龚国平，等.糖尿病及他汀类药物治疗对稳定型心绞痛患者循环微小RNA-92a表达的影响研究[J].中国全科医学，2016，19(24)：2876-2879.[www.chinagp.net]

WANG H，LIN Y Z，GONG G P，et al.Influence of diabetes and statin therapy on expression of circulating microRNA-92a in patients with stable angina pectoris[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2876-2879.

随着老龄化社会的发展，老年人心血管系统结构发生退行性改变，功能下降，年龄相关性疾病增多。而所有年龄相关性疾病有一个共性，即炎性反应[1]。微小RNA(microRNAs，miRNAs)是近年发现的小的内生性单股无编码的由18～24个核苷酸组成的RNA，miRNAs是基因表达的重要调节器。越来越多的证据证明，miRNAs不仅在正常组织的发生、发展及生理特点中起到关键作用，而且对糖尿病、癌症、心脏病、炎症的发生发展有重要影响[2-5]。研究发现miRNAs与内皮完整性[6]、致动脉粥样硬化脂质所导致的巨噬细胞炎性反应[7]、血管平滑肌细胞增殖[8]及脂蛋白的合成[9]有关。本研究旨在探讨稳定型心绞痛(stable angina pectoris，SAP)患者循环微小RNA-92a(microRNA-92a，miR-92a)表达与糖尿病及他汀类药物治疗的关系。

1　对象与方法

1.1研究对象选取2010年3月—2011年3月在广西壮族自治区人民医院心内科住院的SAP患者116例，其中男88例，女28例；年龄33～84岁，平均年龄(62.9±10.8)岁，≥60岁66例，<60岁50例；96例合并高脂血症，70例合并高血压，30例合并糖尿病。排除1型糖尿病、恶性肿瘤、外周血管病变、增生性视网膜病变、炎症、急性出血或输血史及促红细胞生成素使用史、未绝经妇女。本研究经本院伦理委员会审议后同意实施，患者均签署知情同意书。

1.2诊断标准SAP诊断符合慢性稳定型心绞痛诊断与治疗指南[10]。高脂血症以低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)>1.8 mmol/L判定[11]。2型糖尿病诊断依据[12]：糖化血红蛋白(HbA1c)≥6.5%或空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L(空腹是指禁食碳水化合物至少8 h)或口服葡萄糖耐量试验(OGTT)餐后2 h血糖(2 hPG)≥11.1 mmol/L或有典型高血糖或高血糖危象症状的患者随机血糖(RPG)≥11.1 mmol/L。

1.3他汀类药物治疗患者在入院前从未服用他汀类药物或者此次发病前停服他汀类药物归为非他汀类药物治疗，共70例(60.3%)；患者在入院前一直未间断服用他汀类药物归为他汀类药物治疗，共46例(39.7%)，其中服用阿托伐他汀33例(71.7%)，瑞舒伐他汀6例(13.0%)，辛伐他汀5例(10.9%)，普伐他汀1例(2.2%)，氟伐他汀1例(2.2%)；入院前连续服用他汀类药物的时间为1个月～1年。

1.4循环miR-92a测定

1.4.1外周血单个核细胞分离患者均在入院后次日清晨抽取外周静脉血10 ml，与等量含肝素的磷酸盐缓冲液(PBS)混匀后，加入密度为1.077 g/ml的Ficoll-Paque分离液(Sigma公司)，以2 000 r/min离心30 min，离心半径19 cm，吸取中间界面的白色絮状单核细胞层，加入PBS，以上述相同的条件进行离心，去除残留的Ficoll-Paque分离液。

1.4.2总RNA抽提将外周血单核细胞加入Trizol(美国Invitrogen公司)裂解，按产品说明书一步法抽提总RNA。

1.4.3RT-qPCR检测循环miR-92a表达水平使用All-in-One miRNATMqPCR检测试剂盒(Gene Copoeia公司)，其中包括2.5 U/μl Poly A Polymerase，RTase Mix、5×Reaction缓冲液、ddH2O(RNase/DNase free)、2×All-in-OneTMqPCR Mix、50×ROX Reference Dye、100 μmol/L Universal Adaptor PCR Primer，按照说明书进行：(1)通过Poly A Polymerase 对miRNA 3′加“Poly A”处理；(2)采用M-MLV RTase及独特的Oligo dT Adaptor引物对Poly A化的RNA进行反转录；(3)采用含有SYBR Green的All-in-OneTMqPCR Mix于罗氏Lightcycler qPCR仪对目的基因miR-92a的表达进行特异性检测。反应条件为：第一步95 ℃ 10 min后，第二步95 ℃ 10 s，之后每20 s降低2 ℃，直至72 ℃ 10 s，共进行40个循环，在循环结束后立即进行溶解曲线分析。每例样本均经双孔重复。hsa-miR-92a基因引物序列为5′-UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU-3′。U6序列为5′-CAAGGATGACACGCAAATTCG-3′，产物经溶解曲线单峰验证，于T阶段采集信号获得Ct值，以上由经验丰富的PCR实验技师专人操作，采用双盲法，计算测试基因与内参基因snRNA U6比值，作相对量分析，用2-ΔΔCt法计算miR-92a的表达水平，经Johnson转换[13]后数值表示循环miR-92a表达水平。

2　结果

2.1SAP患者循环miR-92a表达水平SAP患者循环miR-92a表达水平为(0.53±0.44)，中位数为0.32〔95%CI(-0.79，0.70)〕。Pearson相关分析结果显示，SAP患者年龄与循环miR-92a表达水平呈正相关(r=0.217，P=0.019)。

2.2糖尿病及他汀类药物治疗对SAP患者循环miR-92a表达水平的影响合并糖尿病患者循环miR-92a表达水平为(0.72±1.07)，未合并糖尿病患者循环miR-92a表达水平为(-0.27±0.97)。以循环miR-92a为因变量，以年龄为协变量，协方差分析糖尿病对循环miR-92a表达水平的影响，结果显示，糖尿病与年龄对循环miR-92a表达水平的影响存在交互作用(P<0.05)，糖尿病对循环miR-92a表达水平主效应不显著(P>0.05)，年龄对循环miR-92a表达水平主效应不显著(P>0.05，见表1)。接受他汀类药物治疗患者循环miR-92a表达水平为(0.42±0.03)，未接受他汀类药物治疗患者循环miR-92a表达水平为(0.88±0.20)。以循环miR-92a为因变量，以年龄为协变量，协方差分析他汀类药物治疗对循环miR-92a表达水平的影响，结果显示，他汀类药物治疗与年龄对循环miR-92a表达水平的影响存在交互作用(P<0.05)，他汀类药物治疗对循环miR-92a表达水平主效应不显著(P>0.05)，年龄对循环miR-92a表达水平主效应显著(P<0.05，见表2)。

2.3他汀类药物治疗对老年合并糖尿病的SAP患者循环miR-92a表达水平的影响以循环miR-92a为因变量，方差分析老年、糖尿病、他汀类药物治疗三因素二水平对循环miR-92a表达水平的影响。结果显示，糖尿病偏差平方和为26.857，P<0.001；老年、糖尿病、他汀类药物治疗交互作用偏差平方和为15.557，P<0.001。多因素方差分析结果显示，老年合并糖尿病接受他汀类药物治疗的SAP患者循环miR-92a表达水平低于未接受他汀类药物治疗的SAP患者，差异有统计学意义(P<0.05)；老年未合并糖尿病的SAP患者，是否接受他汀类药物治疗者循环miR-92a表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表3)。

表1糖尿病与年龄对SAP患者循环miR-92a表达水平的影响

Table 1Effect of diabetes and age on the expression of circulating miR-92a in SAP patients

因素Ⅲ型平方和自由度均方F值P值糖尿病0.77510.7750.8390.362年龄1.40811.4081.5240.220糖尿病×年龄15.011115.01119.6310.001

表2他汀类药物治疗与年龄对SAP患者循环miR-92a表达水平的影响

Table 2Effect of statin therapy and age on the expression of circulating miR-92a in SAP patients

因素Ⅲ型平方和自由度均方F值P值他汀类药物治疗4.46114.461<0.0010.998年龄4.24914.2493.9860.048他汀类药物治疗×年龄0.00110.0012.3460.036

Table 3Effect of statin therapy on the expression of circulating miR-92a in elderly SAP patients

接受他汀类药物治疗例数循环miR-92aF值P值合并糖尿病22.0800.001 是120.20±0.66 否101.44±0.55未合并糖尿病<0.0010.992 是17-0.16±0.73 否27-0.16±1.21

注：miR-92a=微小RNA-92a

3　讨论

冠状动脉粥样硬化是SAP的主要发病基础，研究发现循环miR-92a过表达可减少抗动脉粥样硬化血流调控性转录因子KLF2的表达，其在氧化应激条件下，经固醇调节元件结合蛋白2(SREBP2)激活调控下由内皮细胞释放入血，诱发巨噬细胞介导的炎性反应，继而诱发或加速动脉粥样硬化[14]。目前有研究认为循环miR-92a可能是内皮细胞损伤的启动或高度相关性因素[14]。老年人冠心病发病率高，且常并存高血压、高脂血症、糖尿病等疾病。本研究结果显示，年龄与循环miR-92a表达水平呈正相关。既往文献表明，高脂血症、高血压对SAP患者循环miR-92a表达水平无影响[15]，因此本研究重点分析糖尿病及他汀类药物治疗对SAP患者循环miR-92a表达水平的影响。

2型糖尿病时机体处于高血糖、胰岛素抵抗、血脂代谢紊乱等异常代谢状态，血管内皮功能受损，血管内皮分泌的内皮素、一氧化氮等血管活性物质失调。血管内皮损伤是糖尿病早期发生器官功能障碍的重要原因。研究表明在高糖环境下，内皮细胞可发生不同程度的代谢及结构改变，导致血管功能紊乱[16]，加速动脉粥样硬化的发生与发展，增加心肌梗死和脑卒中的发生率[17]。内皮功能紊乱是冠心病、糖尿病血管并发症发生的关键和始动环节。动脉粥样硬化是多种因素共同作用，如脂质在动脉壁蓄积致慢性炎性反应而成。而早期粥样斑块形成及进展的最主要因素是内皮完整性的消失。内皮功能异常导致内皮下富含脂质的脂蛋白的蓄积，血管舒张功能受限，继而促炎性反应及血栓形成[17]。本研究结果表明，糖尿病与年龄对循环miR-92a表达水平存在交互作用，提示循环miR-92a表达水平可能与血管炎性反应、血管内皮功能紊乱相关。对合并糖尿病的冠心病患者更应强化改善内皮功能的治疗。

虽然目前尚未完全清楚循环miRNAs的确切功能，但其与多种病理过程密切相关是被广泛接受的。最近研究发现，miRNAs与炎性反应过程及内皮功能有密切关系[18-19]。WU等[20]发现在人脐静脉内皮细胞体外实验中，循环miR-92a过表达可减少抗动脉粥样硬化血流调控性转录因子KLF2的表达。KLF2在mRNA及蛋白质水平上调控内皮型一氧化氮合酶及血栓调节蛋白[21]，进而引发炎性反应，促进炎性细胞与内皮细胞的黏附和血栓形成。研究发现内皮祖细胞通过转换成新生的健康的内皮细胞以替换凋亡或者受损的内皮细胞进而维持内皮完整性[22]。有研究表明他汀类药物可通过下调miRNAs的表达，进而改善内皮祖细胞的功能及数量[23]。本研究结果表明，老年合并糖尿病接受他汀类药物治疗的SAP患者循环miR-92a表达水平低于未接受他汀类药物治疗的SAP患者，提示他汀类药物通过调控循环miR-92a治疗血管内皮损伤可能具有临床应用价值。

作者贡献：王虹进行试验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；龚国平、马春兰、伍崇信进行试验实施、评估、资料收集；林英忠进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：贾萌萌)

Influence of Diabetes and Statin Therapy on Expression of Circulating MicroRNA-92a in Patients With Stable Angina Pectoris

WANGHong，LINYing-zhong，GONGGuo-ping，MAChun-lan，WUChong-xin.

DepartmentofCardiology，thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Nanning530021，China

LINYing-zhong，DepartmentofCardiology，thePeople′sHospitalofGuangxiZhuangAutonomousRegion，Nanning530021，China；E-mail：yingzhonglin@126.com

ObjectiveTo investigate the relationship among expression level of circulating microRNA-92a(miR-92a)，diabetes and statin therapy in patients with stable angina pectoris(SAP).Methods116 SAP patients，who were in the People′s Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region from March 2010 to March 2011，were selected，including 30 patients with diabetes and 46 patients with statin therapy.The circulating miR-92a was detected by RT-qPCR.The difference of the circulating miR-92a expression level in SAP patients with or without combination of diabetic and statin therapy；and the difference of the circulating miR-92a expression level in elderly SAP patients with or without statin therapy were compared.ResultsThe expression level of miR-92a in SAP patients was(0.53±0.44).The results of Pearson correlation analysis showed that the age of SAP patients was positively correlated with the expression level of miR-92a(r=0.217，P=0.019).With the circulating miR-92 as the dependent variables and age as covariate，covariance analysis showed that diabetes and age had interaction effects on the circulating miR-92a(F=19.631，P<0.05)；statin therapy and age had interaction effects on the circulating miR-92a(F=2.346，P<0.05).The results of multi-factor analysis of variance showed that the expression level of circulating miR-92a in elderly SAP combined with diabetes patients who received statin therapy was lower than that in SAP patients who did not receive statin therapy(F=22.084，P=0.001)；whether receiving statin therapy or not，the circulating miR-92a expression levels of SAP patients combined with diabetes showed no significant differences(F<0.001，P=0.992).ConclusionDiabetes and statin therapy have effect on the expression level of circulating miR-92a in SAP patients.Statin therapy can lower the circulating level of miR-92a in SAP patients combined with diabetes，which indicates that statin may improve endothelial function through regulating and controlling miR-92a.

Angina，stable；Aged；Diabetes mellitus；Statin；MicroRNAs

国家自然科学基金资助项目(81360055)；广西卫生厅重点课题(S201315-04)；广西南宁市青秀区科技攻关课题(2014S06)

530021 广西南宁市，广西壮族自治区人民医院心内科

林英忠，530021 广西南宁市，广西壮族自治区人民医院心内科；E-mail：yingzhonglin@126.com

R 541.4

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.001

2015-12-23；

2016-06-18)