骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9在子宫内膜异位症患者内膜中的表达情况及孕激素对其表达的影响

杨 眉，蒋春樊，哈春芳



·论著·

·专题研究·

骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9在子宫内膜异位症患者内膜中的表达情况及孕激素对其表达的影响

杨 眉，蒋春樊，哈春芳

目的探究子宫内膜异位症(EMs)患者内膜中骨桥蛋白(OPN)及基质金属蛋白酶9(MMP-9)的表达情况及二者的相关性,以及不同剂量孕激素对其表达的影响。方法选取2006—2015年在宁夏医科大学总医院住院治疗的符合纳入标准的EMs患者105例，术前1 d行诊刮术获得在位内膜(EMs在位内膜组)，由卵巢囊肿剥除术或患侧附件切除术切除组织获得异位内膜(EMs异位内膜组)。另选取同期行输卵管绝育手术的患者90例作为对照，绝育手术前1 d行诊刮术获取子宫内膜(正常子宫内膜组)。采用免疫组化法检测3组内膜中OPN及MMP-9表达情况，并分析EMs在位内膜组、EMs异位内膜组OPN与MMP-9的相关性。2013年1—3月，从105例患者中随机选取9例患者的在位内膜组织进行后续试验，采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测不同剂量(0、1、10、100、1 000 nmol/L)孕激素干预后在位内膜腺上皮细胞中OPN、MMP-9 mRNA表达水平。结果免疫组化法染色结果显示，正常子宫内膜组在位内膜DAB染色后腺上皮细胞呈淡黄色，OPN、MMP-9均主要表达于内膜腺上皮细胞中；EMs在位内膜组DAB染色后腺上皮细胞染色加深，呈棕黄色；EMs异位内膜组腺上皮细胞染色进一步加深，呈棕黑色，OPN和MMP-9主要表达于EMs腺上皮细胞中。EMs异位内膜组OPN、MMP-9表达情况强于EMs在位内膜组、正常子宫内膜组(u值分别为7.553、-6.153、-9.754、-10.240，P<0.001)；EMs在位内膜组OPN、MMP-9表达情况强于正常子宫内膜组(u值分别为7.164，8.816，P<0.001)。Spearman相关分析结果显示，EMs在位内膜组、EMs异位内膜组中OPN与MMP-9表达水平均呈正相关(rs值分别为0.657、0.745，P<0.05)。0、1、10、100、1 000 nmol/L孕激素分别干预EMs腺上皮细胞后，其OPN及MMP-9表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。结论OPN、MMP-9在EMs患者在位、异位内膜中表达均增强，但不同剂量孕激素对EMs患者在位内膜腺上皮细胞OPN、MMP-9表达水平影响不明显。

子宫内膜异位症；骨桥蛋白质；基质金属蛋白酶9；孕激素类

杨眉，蒋春樊，哈春芳.骨桥蛋白与基质金属蛋白酶9在子宫内膜异位症患者内膜中的表达情况及孕激素对其表达的影响[J].中国全科医学，2016，19(24)：2920-2924.[www.chinagp.net]

YANG M,JIANG C F,HA C F.Expression of osteopontin and matrix metalloproteinase 9 in the endometrium of patients with endometriosis and influence of progesterone on their expression[J].Chinese General Practice，2016，19(24)：2920-2924.

不同个体对子宫内膜异位症(EMs)的易感性与遗传、激素水平及环境因素有关[1]，但其具体分子机制尚不明确。骨桥蛋白(OPN)是一种结合糖蛋白型的整联蛋白，其首先在骨基质中被发现，而后又发现其与肿瘤细胞的黏附、抗凋亡及转移有关[2]。金属基质蛋白酶9(MMP-9)与肿瘤发生发展有关。有研究显示，OPN能够活化PI 3-K/AKt通路，与avβ3整合素结合，通过一系列分子相互作用，上调尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，从而活化MMP-9，降解细胞外基质，进而促进肿瘤细胞的转移[3]。OPN在月经周期中晚分泌期的表达水平较高，而在增生期和早分泌期表达水平相对较低[4]。MMP-9则在月经周期晚分泌期的表达水平较高[5]。EMs患者子宫内膜组织中OPN及其mRNA表达水平及血液中分泌型糖蛋白形式的OPN均较正常人升高[6]。有研究显示，EMs患者子宫内膜组织中MMP-9的表达水平相对较高[7]。OPN及MMP-9的表达水平随月经周期变化,且均在EMs患者子宫内膜组织中高表达，从而推论两者之间可能存在关联，其表达水平可能受雌、孕激素调节。本课题组前期已研究了雌激素对OPN及MMP-9表达水平的影响[8]，本研究进一步分析了孕激素对OPN及MMP-9的表达水平的影响，现报道如下。

1　材料与方法

1.1纳入与排除标准纳入标准：(1)Ⅳ期EMs患者(依据美国生育协会1985年“修正子宫内膜异位症分期法”[9])；(2)处于月经分泌期；(3)因卵巢巧克力囊肿行卵巢囊肿剥除术或患侧附件切除术。排除标准：(1)合并重大内科疾病；(2)术前6个月曾接受激素治疗者。

1.2组织来源选取2006—2015年在宁夏医科大学总医院住院治疗的符合纳入标准的EMs患者105例，术前1 d行诊刮术(术前诊刮术是为行内膜活检、排除内膜病变决定手术范围)获得在位内膜(EMs在位内膜组)，由卵巢囊肿剥除术或患侧附件切除术切除组织获得异位内膜(EMs异位内膜组)。样本组织经两位病理学主任医师进行HE染色切片复验，均再次确诊为EMs。另选取同期行输卵管绝育手术的患者90例作为正常子宫内膜组，均处于月经分泌期，术中排除合并EMs者，绝育手术前1 d行诊刮术获取子宫内膜。

1.3免疫组化法获取样本组织后立即置入4%中性甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片4 μm，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱去二甲苯，3%过氧化氢溶液去除内源性过氧化物酶，高压热修复抗原后山羊血清封闭。小鼠抗人OPN及MMP-9单克隆抗体(美国Abcam公司，均为1∶100稀释)，4 ℃孵育过夜。采用北京中杉金桥生物技术有限公司两步法广谱羊抗小鼠二抗试剂盒(PV-9000，含A液和B液)放大信号，A液和B液分别孵育30 min。二氨基联苯胺(DAB)显色(显色时间根据显微镜下观察所见进行调控，待阳性信号明显而背景信号未显现时即停止显色)；苏木精复染，中性树胶封固。

1.4OPN及MMP-9表达情况判定标准每张切片选取10个不重叠的高倍视野(×400)进行观察，OPN、MMP-9免疫组化染色阳性的标准为细胞膜或细胞质中有棕黄色颗粒，采用半定量积分法进行结果判定，分别对染色强度和镜下阳性细胞表达率给予评分：(1)阳性染色强度：未染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕黑色为3分；(2)阳性细胞表达率：高倍视野下阳性细胞数占所有细胞数的比例即为表达率，表达率<5%为0分，表达率5%～24%为1分，表达率25%～50%为2分，表达率>50%为3分。两者评分之和作为综合评分：总分0分记为阴性(-)，总分1～2分记为弱阳性(+)，总分3～4分记为阳性(++)，总分5～6分记为强阳性(+++)。

1.5细胞培养及药物干预2013年1—3月，从105例患者中随机选取9例患者的在位内膜组织进行后续试验。取出低温保存的在位内膜组织，采用无菌无酚红Hanks平衡盐溶液(HBSS)清洗3次，剪成约1 mm3大小，10 ml HBSS(3×)溶解的胶原酶Type Ⅳ在37 ℃消化10 min；500 r/min离心(离心半径为16 cm)1 min，悬浮的上皮细胞和间质细胞经离心后分离，去除上清液(主要含悬浮的间质细胞)，加入含10%胎牛血清的无酚红的DMEM/Ham′s F12培养液(含链霉素100 μg/ml、青霉素100 U/ml、氟康唑2 μg/ml)培养腺上皮细胞，分装在多个直径为10 cm的培养皿中。隔日换液直至细胞达到60%融合时，吸去培养液，将细胞置于无胎牛血清的DMEM/Ham′s F12培养液中12 h。将不同培养皿中腺上皮细胞的培养液更换为含不同剂量(0、1、10、100、1000 nmol/L)孕激素的DMEM/Ham′s F12培养液，并加入活性炭，进一步去除胎牛血清，培养24 h。1.6反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测腺上皮细胞中OPN、MMP-9 mRNA表达水平Trizol裂解细胞,采用紫外分光光度计测量其在260 nm和280 nm处的OD值,并计算RNA的纯度和浓度。反转录反应体系配置：总体积20 μl，包括上一步变性处理的RNA溶液12 μl、dNTP混合物 (各10 mM)2 μl、RNA酶抑制剂(10 U/μl)1 μl、5×RT Buffer 4 μl、ReverTra Ace 1 μl。反转录后进行PCR，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，OPN上游引物为5′-ACAGCCGTGGGAAGGACAGTTA-3′，下游引物为5′-CCTGACTATCAATCACATCGGAATG-3′；MMP-9上游引物为5′-AGTCCACCCTTGTGCTCTTCCC-3′，下游引物为5′-TCTGCCACCCGAGTGTAACCAT-3；β-actin上游引物为5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′，下游引物为5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′。 扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，变性、退火、延伸共循环40次。结束前72 ℃再延伸7 min，4 ℃保存。采用2-ΔΔCt法计算OPN、MMP-9 mRNA表达水平。

2　结果

2.1免疫组化染色结果正常子宫内膜组DAB染色后腺上皮细胞呈淡黄色，OPN、MMP-9均主要表达于内膜腺上皮细胞中。EMs在位内膜组DAB染色后腺上皮细胞染色加深，呈棕黄色；EMs异位内膜组腺上皮细胞染色进一步加深，呈棕黑色，OPN和MMP-9主要表达于EMs腺上皮细胞中(见图1，本文图1彩图见本刊官网www.chinagp.net电子期刊相应文章附件)。

2.2OPN、MMP-9在EMs异位内膜组、在位内膜及正常子宫内膜组中表达情况正常子宫内膜组、EMs在位内膜组、EMs异位内膜组OPN、MMP-9表达情况比较，差异有统计学意义(P<0.05)；EMs异位内膜组OPN、MMP-9表达情况强于EMs在位内膜组、正常子宫内膜组，差异有统计学意义(u值分别为7.553、-6.153、-9.754、-10.240，P<0.001)；EMs在位内膜组OPN、MMP-9表达情况强于正常子宫内膜组，差异有统计学意义(u值分别为7.164、8.816，P<0.001，见表1)。

2.3EMs在位内膜组、EMs异位内膜组OPN与MMP-9的相关性分析Spearman相关分析结果显示，EMs在位内膜组、EMs异位内膜组OPN与MMP-9表达水平均呈正相关(rs值分别为0.657、0.745，P值分别为0.013、0.018)。

2.4不同剂量孕激素干预EMs腺上皮细胞后OPN、MMP-9 mRNA表达水平比较0、1、10、100、1 000 nmol/L孕激素干预EMs腺上皮细胞后，其OPN、MMP-9 mRNA表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05，见表2)。

注：A为正常子宫内膜组，B为EMs在位内膜组，C为EMs异位内膜组

图1免疫组化法染色结果

Figure 1Result of immunohistochemical staining

表13组OPN、MMP-6表达情况比较(例)

Table 1Comparsion of expression status of OPN and MMP-9 among the three groups

组别例数 OPN- + +++++ MMP-9- + +++++正常子宫内膜组9027362704527180EMs在位内膜组10561860213216615EMs异位内膜组105061584392469H值12.3514.28P值0.0040.003

注：EMs=子宫内膜异位症，OPN=骨桥蛋白，MMP-9=基质金属蛋白酶9

Table 2Comparsion of the expression levels of OPN and MMP-9 mRNA after intervention of different doses of progesterone in EMs glandular epithelial cells

孕激素(nmol/L)OPNmRNAMMP-9mRNA01.001.0011.05±0.180.93±0.11101.08±0.220.97±0.191001.11±0.120.92±0.2910001.03±0.330.95±0.16F值8.627.38P值0.1010.182

3　讨论

EMs是一种妇科常见病，且发病机制复杂，可能与甾体激素类药物、免疫分子、遗传物质、环境因素等多种生物活性因素相关[1,10]。子宫内膜的分离、接触、黏附、侵袭等一系列生物行为均在早期EMs的发生发展过程中发挥作用[11]。部分相关研究显示，与恶性肿瘤病理过程密切相关的蛋白，同样与EMs密切相关，如OPN及MMP-9等[12-13]。为进一步阐明EMs的发病机制，本研究选取了EMs患者的在位、异位内膜，并以正常子宫内膜作为对照，用免疫组化法检测内膜中OPN及MMP-9表达情况，以明确OPN和MMP-9是否在EMs患者的内膜中表达增强，因本课题组前期研究已明确雌激素对OPN及MMP-9表达情况的影响[8]，故本研究拟观察孕激素对OPN及MMP-9表达情况的影响，旨在为EMs的临床治疗提供分子理论基础。

本研究结果显示，EMs异位内膜组OPN、MMP-9表达情况强于EMs在位内膜组、正常子宫内膜组，且EMs在位内膜组OPN、MMP-9表达情况强于正常子宫内膜组；表明OPN及MMP-9在EMs患者在位、异位内膜中表达均强于非EMs患者。进一步分析OPN与MMP-9的关系显示，EMs患者异位内膜、在位内膜中OPN与MMP-9均呈正相关，与相关研究结果一致[14]。RANGASWAMI等[15]研究结果显示，在恶性肿瘤的发病过程中，OPN与MMP-9可促进肿瘤细胞的侵袭、转移及肿瘤血管生成，MMP-9 活化有赖于 OPN的表达增强，而MMP-9的活化加速了肿瘤的扩散。OPN能通过激活细胞内一系列分子进行信号传导，最终活化MMP-9,进而溶解细胞外基质,导致细胞的异地黏附、侵袭与转移[16-17]。

本研究采用不同剂量孕激素干预EMs腺上皮细胞发现，0、1、10、100、1 000 nmol/L孕激素干预EMs腺上皮细胞后，OPN及MMP-9表达水平间无差异。孕激素调控OPN的分子机制复杂，JOHNSON等[18]采用孕激素喂养卵巢切除后的母羊发现，子宫内膜间质细胞上的孕激素受体上调，而腺上皮细胞中却缺乏孕激素受体，接着用受体拮抗剂ZK137,316喂养已经进食孕激素的卵巢切除后的母羊发现，OPN的表达水平明显下降，推测孕激素对OPN的调控机制复杂，其中包括腺上皮细胞孕激素受体下调，而孕激素对OPN的调控需有间质细胞来源的旁分泌生长因子参与方可发挥作用。而孕激素调控MMPs方面的研究较多，MÖNCKEDIECK等[19]研究结果显示，在人子宫内膜中，孕激素通过上调特定的肿瘤生长因子来调控细胞间的相互作用及组织的周期性变化，其中起主要作用的是转化生长因子β(TGF-β)。TGF-β受体则主要分布在子宫内膜间质细胞上，但本研究采用的是原代培养的子宫内膜腺上皮细胞进行体外试验，排除了子宫内膜间质细胞，故推测孕激素对EMs的抑制作用可能需要子宫内膜间质细胞的存在。

综上所述，OPN、MMP-9在EMs患者在位、异位内膜中表达增强，但不同剂量孕激素对EMs患者在位内膜腺上皮细胞OPN、MMP-9表达水平影响不明显。本研究选取子宫内膜腺上皮细胞进行离体试验，排除了子宫内膜间质细胞，故结果存在一定局限性。而人体内子宫内膜腺上皮细胞与间质细胞间是否存在复杂的相互关联与作用，本课题组拟进一步探究。

作者贡献：杨眉进行试验设计与实施、资料收集整理、撰写论文、成文并对文章负责；杨眉、蒋春樊进行试验实施、评估、资料收集；哈春芳进行质量控制及审校。

本文无利益冲突。

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(本文编辑：毛亚敏)

Expression of Osteopontin and Matrix Metalloproteinase 9 in the Endometrium of Patients With Endometriosis and Influence of Progesterone on Their Expression

YANGMei,JIANGChun-fan,HAChun-fang.

DepartmentofObstetricsandGynecology,XiangyangCentralHospital,AffiliatedHospitalofHubeiUniversityofArtsandScience,Xiangyang441021;NingxiaMedicalUntversity,Yinchuan750004,China

HAChun-fang,DepartmentofGynecology,GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity;KeyLaboratoryofFertilityPreservationandMaintenanceoftheMinistryofEducation,Yinchuan750004,China;E-mail:hachunfang@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and correlation of osteopontin (OPN) and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) in the endometrium of patients with endometriosis (EMs),and the influence of different doses of progesterone on their expression.Methods105 patients with EMs,who received treatment in General Hospital of Ningxia Medical University from 2006 to 2015 and met the inclusion criteria,were selected in the study.The eutopic endometrium was got 1 d before surgery by curettage (EMs eutopic endometrium group).The ectopic endometrium was got through oophorocystectomy or tissue adnexectomy (EMs ectopic endometrium group).In addition,90 patients who had underwent sterilization operation of fallopian tube and the endometrium was got through curettage 1 d before sterilization operation (normal endometrium group).Immunohistochemistry was used to detect the expression status of OPN and MMP-9 in the endometrium among the three groups,and the correlation of OPN and MMP-9 between EMs eutopic endometrium group and EMs ectopic endometrium group were also analyzed.The eutopic endometrium of 9 patients were randomly selected from the 105 patients to carry out follow-up experiment,inverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was applied to detect the expression levels of OPN and MMP-9 in the endometrial epithelial cells after progesterone intervention at different doses (0,1,10,100,1 000 nmol/L).ResultsImmunohistochemistry results showed that the color of endometrium epithelial cells in eutopic endometrium after DAB staining in normal endometrium group was light yellow,and OPN and MMP-9 were mainly expressed in endometrium epithelial cells.The staining of endometrium epithelial cells in EMs eutopic endometrium group darkened and presented brown.The staining of endometrium epithelial cells in EMs ectopic endometrium group darkened further and showed brownish black,and OPN and MMP-9 were mainly expressed in EMs epithelial cells.The expression levels of OPN and MMP-9 in EMs ectopic endometrium group were stronger than those in EMs eutopic endometrium group and normal endometrium group (u=7.553,-6.153,-9.754,-10.240,P<0.001);the expression levels of OPN and MMP-9 in EMs eutopic endometrium group was stronger than those in normal endometrium group (u=7.164,8.816,P<0.001).The result of Spearman correlation analysis was shown as follows:the expression levels of OPN and MMP-9 between eutopic and ectopic endometrium group were positively correlated with each other (rs=0.657,0.745,P<0.05).After intervention of progesterone at different doses of 0 nmol/L,1 nmol/L,10 nmol/L,100 nmol/L,and 1 000 nmol/L,the expression levels of OPN and MMP-9 were not significantly different (P>0.05).ConclusionEnhanced expression of OPN and MMP-9 in eutopic and ectopic endmetrium of patients with EMs was presented,but different doses of progesterone has no significant influence on the expression level of OPN and MMP-9 in the eutopic endometrium epithelial cells of EMs patients.

Endometriosis；Osteopontin；Matrix metalloproteinase 9；Progestins

国家自然科学基金资助项目(81160078)

441021 湖北省襄阳市中心医院 湖北文理学院附属医院妇产科(杨眉)，病理科(蒋春樊)；宁夏医科大学(杨眉)；宁夏医科大学总医院妇科，生育力保持重点实验室(哈春芳)

哈春芳，750004宁夏银川市，宁夏医科大学总医院妇科，生育力保持重点实验室；E-mail：hachunfang@163.com

R 711.71

ADOI：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.24.010

2016-03-05；

2016-07-12)