内蒙古乌兰察布布氏菌分离株种型鉴定及流行病学特征分析

刘志国，王　妙，刘日宏，赵鸿雁，朴冬日，崔步云，夏咸柱



内蒙古乌兰察布布氏菌分离株种型鉴定及流行病学特征分析

刘志国1,2,3，王妙3，刘日宏3，赵鸿雁4，朴冬日4，崔步云4，夏咸柱5

目的鉴定临床分离布氏菌种型，并分析患者的流行病学特征。方法以牛种、羊种、猪种标准参考菌株为试验对照，采用经典方法和VITEK2.0进行初步鉴定，用AMOS-PCR进行确证，并分析患者的流行病学特征。结果经典鉴定115株均为羊种菌，羊3型93株，羊1型22株；115株菌ProA、TyrA、URE和GlyA全部阳性；91株ELLM阳性、14株APPA阳性，提示均为布氏菌，其中羊种菌91株，猪种菌14株。与经典实验的鉴定符合率比较鉴定布氏菌属100%，鉴定布氏菌种为79%(91/115)；AMOS-PCR均获得了约731 bp的特异性扩增条带，证实全部为羊种菌。初诊患者84例，构成比为73%；临床表现以疼痛、发热、乏力、多汗居多；88例患者就诊前无用药史，2例有布病治疗史。结论VITEK2.0是一种高效的布氏菌鉴定方法，但不能替代经典方法；羊种3型菌为该地区的主要流行菌种，再感染可能是慢性患者或有布病治疗史患者分离到布氏菌的主要因素，初诊、未用抗生素且症状典型是分离布氏菌的重要指标。

布氏菌；种型鉴定；流行病学

Funded by the Medical and Hygiene Research Projects of Inner Mongolia Health and Family Planning Commission (No. 201301094)

布氏菌病(布病)是由布氏菌属细菌侵入机体引起的人兽共患传染-变态反应性疾病，是《中华人民共和国传染病防治法》中规定报告的乙类传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类动物疫病。布病在世界范围内广泛流行，是全球特别是发展中国家面临的主要公共卫生问题[1-2]。中国是布病的历史疫区，特别是在西北和东西地区，布病流行较为严重。进入新世纪后，全国布病发病呈逐年上升趋势，发病范围不断扩大，疫点不断增加[3]。在内蒙古101个旗县市区中有94个是人间布病历史疫区。中国的布病病例约1/4来自内蒙古，而2011年乌兰察布市的布病病例数占内蒙古的39.6%[4]。近年，在采取一系列重要举措后，该地区布病的高发态势得到了有效遏制，但人畜间布病防控形势依然严峻[5]。为了系统的了解乌兰察布地区布病流行规律和病原特点，对分离的布氏菌菌株进行多种方法的鉴定，对相应患者的流行病学特征进行分析，以期为该地区布病防控提供参考。

1　材料和方法

1.1菌株来源115株布氏菌分离自乌兰察布市地方病防治中心就诊的患者血液样本，牛种(544A)、羊种(16M)、猪种(1330S)标准参考菌株来自于中国疾控中心传染病所(传染病所)布病室。布病实验室检查、临床症状记录以及病例确认判定均按照国家人间布病判定标准和内蒙古人间布病诊疗方案(试行)执行；活菌试验操作在传染病所生物安全3级实验室完成。在乌兰察布的地区划分中，习惯上以大青山以南部分称为前山地区，以北部分称为后山地区，具体地区名称用WS1-11表示，周边地区用ZB1-3表示，WS-12即地址未知。

1.2流行病学资料收集整理2011-2015年间在乌兰察布市地方病防治中心分离的115株布氏菌的相关资料和病历，包括性别、年龄、民族、职业、接触史以及病原种型、病原分布、菌种地区分布、样本及患者实验室检查结果、临床症状表现等有关情况进行汇总分析。

1.3主要仪器与试剂全自动细菌鉴定及药敏分析系统VITEK 2 .0 Compact 、GN卡(革兰阴性杆菌鉴定卡)(梅里埃)，麦氏细菌浊度仪(DENSIMAT型)、Class 11 A2型生物安全柜(美国Forma公司)，生化培养箱(上海一恒仪器公司)，24孔高速离心机、PCR仪(sigma 德国)，水平电泳槽、电泳仪(北京君意东方电泳设备公司)，凝胶成像系统GelDoc-It310(北京天美仪器公司)，全自动核酸提取仪及试剂TACO-3(台湾瑞基海洋生物技术公司)。

1.4基因组DNA提取严格按照全自动核酸提取仪TACO-3操作步骤和使用说明进行试验菌株和标准参考菌株的基因组DNA提取，测定核酸浓度(260/280)，标记后-20 ℃保存备用。

1.5经典鉴定经典鉴定方法包括标准阳性血清凝集试验；A、M单因子血清凝集试验、硫化氢产生试验、CO2需要、染料抑菌试验及噬菌体裂解试验，具体操作步骤遵照卫生部疾病预防控制局《布鲁氏菌病防治手册》[6]。

1.6全自动细菌鉴定分析取生长48 h待检布氏菌溶解于3 mL灭菌生理盐水中，并稀释为麦氏浊度0.5，用封口膜封口，在封口膜中央靠近VITEK卡槽的一端用无菌锐器扎一小口，将GN鉴定卡导管插入菌悬液中，上机鉴定，鉴定完毕后及时将废弃物高压灭菌处理，并做好废物仓消毒灭菌。鉴定结果分析参照梅里埃(GN卡)布氏菌属和种的生化阳性鉴定标准和参考菌株结果。

1.7AMOS-PCR采用25 μL扩增体系。2×Premix Taq 10 μL，primer IS711(10 pmol/μL)1 μL；primer A、M、O、S(10 pmol/μL)各0.4 μL；DNA 1 μL，高压双蒸水补足体积。扩增参数:95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min；终末延伸72 ℃ 5 min，35个循环。经2%凝胶电泳，120 V，1 h检测扩增产物，凝胶成像系统成像。

2　结　果

2.1经典鉴定结果115例患者血清琥红平板凝集试验全部阳性，其中114例的试管凝集效价1∶100(++)，1例为1∶100(+)。22株为羊种1型菌，93株为羊种3型菌。见表1。

表1115株临床分离布氏菌经典鉴定结果表

Tab.1Classical methods identified result of 115 clinical isolated Brucella

IDSerologicaltestPositiveserumAseraMseraCO2requirementH2SproductionDyeinhibitiontestsPhagelysistestthioninefuchsineBK2104TbWBNo.ofstrainsSpecies/Biovar16M+-+--+++--1羊1544A++-±--+++-1牛11330S++---+-+++1猪122株+-+--+++--22羊193株+++--+++--93羊3

2.2VITEK 2.0实验结果3株参考菌株ProA、TyrA、URE和GlyA全部阳性；牛种参考菌株乳酸盐产碱(1IATK)、ELLMAN(ELLM)阳性；羊种参考菌株ELLMAN(ELLM)、dGLU(D-葡萄糖)阳性；猪种参考菌株APPA阳性； 115株试验菌株的ProA、TyrA、URE和GlyA全部阳性；91株ELLM阳性、14株APPA阳性、11株dGLU阳性，PyrA、H2S和GGAA阳性各1株，提示菌株全部为布氏菌。91株为羊种菌，14株为猪种菌，与经典实验的鉴定符合率为79%(91/115)。生化实验了共检测64项生化指标，本试验中11个生化指标对布氏菌鉴别分析有意义，其余均为阴性，为非布氏菌鉴别指标。该实验每次8 h内完成。见表2。试验菌株的耗时数和可信度均为平均值，耗时范围为6.25～8，可信度范围为97%～99%；ProA为L脯氨酸芳胺酶；TyrA为酪氨酸芳胺酶；URE为尿素酶；GIyA为氨基乙酸芳胺酶；1LATK为乳酸盐产碱；ELLM为ELLMAN；APPA为丙氨酸-苯丙氨酸一脯氨酸芳胺酶；dGLU为D-葡萄糖；PyrA为吡咯烷基芳胺酶；H2S为硫化氢产生；GGAA为谷氨酸-甘氨酸-精氨酸芳胺酶。

2.3AMOS-PCR鉴定结果经扩增和电泳检测，阳性对照扩增获得了预期片段，分别为牛种498 bp、羊种731 bp、猪种275 bp；阴性对照未见扩增。试验菌株均获得了单一、特异的约731 pb扩增条带，条带与对照羊种菌产生的条带一致，判定为羊种布氏菌。详见图1。

表2115株布氏菌全自动生化鉴定结果

Tab.2Automatic biochemical identification results of 115 Brucella strains

菌株Strains牛种B.abortus羊种B.melitensis猪种B.suis试验菌株TeststrainsNo.ofstrains111115Time-consuming86.7587.7probability(%)98999898.8proA111115TyrA111115URE111115GlyA111115Test1LATK1---resultELLM11191APPA--114dGLU-1-11PyrA---1H2S---1GGAA---1

1-3 as positive control, B. abortus 544A, B. melitensis 16M, B. suis 1330S, respectively; 4-47, test strains; lane, 48 negative control图1　布氏菌AMOS-PCR鉴定结果Fig.1　Identification result of Brucella by AMOS-PCR

2.4病例特征分析

2.4.1性别、民族和职业分布在115例患者中，84(73%)例为男性，31(29.6%)例为女性，男女比例约为2.7∶1；112为汉族，2名为蒙族，1名不详，汉族的构成比为97.4%；农民99名，构成比为86%(99/115)、牧民 2名，学生9名，司机 2名，市民 2名，个体1名(经营超市)；布病对性别、民族无选择性，仅与接触有关。

2.4.2年龄分布患者主要集中在40～69岁年龄范围，共计83例，构成比约为72.2%(83/115)，最小为7岁，最大为71，平均年龄46岁。

2.4.3接触史和发病时间115名患者均直接或间接与羊及其产品有接触史，其中初诊84(73%)名，复诊27名，不详3名。从发病后就诊时间来看，发病后30 d之内前来就诊人数最多，为34(29.5%)例；10 d之内为14例，60 d之内11例，半年之内14例，1年之内前来就诊人数23例；1年以上为5例，不详14例。

2.5临床表现布病患者大多数以疼痛、发热、乏力、多汗为主。88例表现疼痛、54例发热、34例乏力、14例多汗。疼痛以腿疼居多，主要包括膝关节和大、小腿肌肉困疼，活动受限；全身疼表现为全身游走性的关节和肌肉酸疼；腰疼多为腰部僵直或单侧腰部疼痛；关节疼以骶髂、胯和肩关节等大关节疼痛为主。综合症状以疼痛和发热最多，其次伴有乏力、多汗、头疼、头晕、胃部不适等多种症状。提示症状典型可作为分离布氏菌的筛选指标，疼痛、发热为必要指标。

表3疼痛症状分布

Tab.3Distribution of pain symptom

疼痛Pain腿疼Legpains全身疼Bodyaches腰疼Lumbago关节疼Jointpain头疼Headache胯疼Hippain脚疼Footpain总计TotalNo.ofcases2717171593288Proportion(%)301919171032100

2.6种型及地理分布93株羊种3型菌和22株羊种1型布氏菌分布于乌兰察布市的11个旗县市区以及周边邻近的锡盟朱日和、张家口尚义和大同市郊区等地；涉及56个乡镇(苏木)，88个自然村(嘎查)；提示羊种3型和1型布氏菌是该地区布病的主要致病菌和流行菌种，混合共存，未分离到其它种型的布氏菌。分布见表4。

表4布氏菌地区及种型分布

Tab.4Region and type distribution of Brucella

旗县市区Districts分区regions菌株数No.ofstrains旗县Districts分区Regions乡镇数No.oftowns村数No.ofvillages种型及数量Speciesandnumber羊3型B.melitensisbv.3羊1型B.melitensisbv.1WS-14762340WS-220718182WS-3前山地区22613175WS-4Qianshanregion18713144WS-555541WS-674661WS-79294663WS-8后山地区63651WS-9Houshanregion98972WS-1044440WS-1111101ZB-1151110ZB-2周边地区32230ZB-3Neighbouringregions11110WS-12Unknown55--32Total4115≥56≥889322

2.7就诊前是否用药及用药情况就诊采样前未服用药物88例；25例曾服用抗生素、感冒药、中药和腰疼药，未服用治疗布病药物；有2例服用布病治疗药物。但使用抗生素后患者仍有布病典型症状，仍可进行布氏菌分离培养。

3　讨　论

目前，布氏菌种型鉴定方法较多，但从实用性和可操作性方面考虑来讲，以经典鉴定和分子鉴定最为常用。全自动细菌生化鉴定系统vitek 2.0基于细菌生化代谢反应在属的水平上鉴别布氏菌，自动化程度高，可同时大批量(60株)的鉴定，结果以PDF形式输出，保存方便，易于解读。但vitek 2.0鉴定需操作活菌，涉及生物安全，需要注意。此次试验共对 118株对照和分离菌株进行了生化鉴定。118株试验菌株的ProA、TyrA、URE和GIyA 均为阳性，结果表明为布氏菌，与经典实验结果基本吻合；其中91株鉴定为羊种菌，14株鉴定为猪种菌，与经典鉴定符合率为79%(91/115)。标准菌株与试验菌株的鉴定可信度与先期实验结果相吻合，试验菌株的可信度>标准菌株的鉴定可信度；鉴定耗时本研究的试验菌株平均耗时7.7 h，略高于先前的研究[7]。试验表明在属的水平上的鉴别结果较为一致。全自动细菌生化鉴定系统鉴定的14株猪种菌和其余试验菌株经AMOS-PCR鉴定确证均为羊种布氏菌，AMOS-PCR与经典方法的鉴定结果具有很高的一致性[8-9]。66%(76/115)的布氏菌分布前山地区，而后山地区的发病率明显高于前山，未知具体地点的菌株均来自于乌兰察布境内。布氏菌的分布与布病发病率的差异可能是由于该试验为被动监测，样品均来自固定地点、临床医师的首诊偏差和漏报等多种因素造成，并未全面反映该地区的布氏菌的地理分布特征，但证实了羊种布氏菌在该地区分布较广，并在周边地区均有分布。提示控制人的疫情首先从控制羊的疫情入手，其它种型布氏菌在该地区的人间布病疫情中发挥较次要的作用。

布病的感染与性别、职业、年龄等因素无统计学意义，主要与接触患病动物相关[10]。25例患者就诊前有非布病药物治疗史，表明其它药物对布氏菌影响较小。用非布病治疗药物史的患者大多属误诊。因布病的临床表现不典型，在首诊时应结合症状仔细询问病史、接触史，在鉴别诊断中应进行血清学试验，以减少误诊[11]。2例患者经口服利福喷丁和四环素治疗40 d后，且仍有布病症状也分离到了布氏菌，需要进行体外药敏试验和耐药相关基因检测以及从分子生物学方法入手，以期获得再感染和确证是否为耐药菌株[12]。

布病患者的临床表现呈现全身性、多器官受损症候[13]。本研究中大多数患者仍表现为典型的布病症状，以腿疼居多，大、小腿的肌肉和膝、髋关节均有疼痛。全身疼的患者主诉为全身疲乏无力、喜卧，并以全身大关节和肌肉游走性酸痛为主；关节疼以骶髂、髋、肩、膝等为主。腰疼多表现为左侧或两侧腰部酸疼或困疼，从而引发胯部、下肢等不适症状，提示布病主要侵害较大的负重关节[14]。急、慢性期患者均可表现为骨关节和肌肉疼痛。急性期患者疼痛多呈大关节游走性疼痛且较剧烈。慢性期以运动系统的损伤最为明显，多为钝痛持续性疼痛。总之，布病的临床表现复杂多变,症状各异。本实验通过对临床分离株种型的鉴定和患者流行病学特点的分析，掌握了该地区布病流行规律和特点，阐明了布病种型和地理分布特征，明确了筛选患者开展血样布氏菌分离培养的主要指标，对今后的深入研究和本地区布病防控具有重要意义。

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Species identification and epidemiological characteristics analysis ofBrucellain Ulanqab, Inner Mongolia, China

LIU ZHi-guo1,2,3, WANG Miao3, LIU Ri-hong3, ZHAO Hong-yan4,PIAO Dong-ri4, CUI Bu-yun4, XIA Xian-zhu5

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,InnerMongoliaAgricultureUniversity,Hohhot010018,China;2.HealthandFamilyPlanningCommissionofUlanqab,Ulanqab012000,China;3.UlanqabCenterforEndemicDiseaseControlandProvention,Ulanqab012000,China;4.NationalInstituteofInfectiousDiseasesControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention/CollaborativeInnovationCenterforDiagnosisandTreatmentofInfectiousDisease,Beijing102206,China;5.InstituteofMilitaryVeterinaryAMMS,Changchun130062,China)

The aim of present study is to identify species/biovar ofBrucellaclinical isolates and to analyze epidemiological characteristics of brucellosis patients. StandardBrucellastrains includingB.abortus,B.melitensis, andB.suiswere used as positive controls. Automatic microbial identification system vitek 2.0 and classical biotyping methods were used for preliminary identification, and then further examined by AMOS-PCR. Epidemiological features of 115 patients were analyzed. Classical identification showed that 115 strains ofBrucellawere allB.melitensis, including 93B.melitensisbiovar 3 strains and 22B.melitensisbiovar 1 strains. All these strains exhibited positive results with ProA, TyrA, URE and GIyA, implying that all strains wereB.melitensis. While there were 91 strains with ELLM positive reaction and 14 strains with APPA positive reaction, indicating that there might be 91B.melitensisstrains and 14B.suisstrains. Compared with classical methods, the Vitek showed a coincidence rate of 100% and 79% on genus and species identification, respectively. A specific 731 bp amplified products were detected for every strain in AMOS-PCR, confirmed that all tested strains wereB.melitensis. There were 84 newly diagnosed patients, covering 73%, with the major clinical symptoms of pain, fever, weakness and sweating. The 88 patients hadn’t taken any medication before diagnosis, while two had a treatment history for brucellosis. Vitlk 2.0 system is an efficient method forBrucellaidentification, but it can not replace classical identification methods yet.B.melitensisbiovar 3 is the major epidemic strains in this region.Brucellaisolated from patients with chronic brucellosis or with treatment history for brucellosis might be because of reinfection. Newly diagnosed patients, no antibiotic treatments and obvious symptoms were important index for obtainingBrucella.

Brucella; species identification; epidemiology

Xia Xian-zhu, Email: xiaxzh@cae.cn

夏咸柱，Email: xiaxzh@cae.cn

1.内蒙古农业大学兽医学院，呼和浩特010018；2.乌兰察布市卫计委，集宁012000；3.乌兰察布市地方病防治中心，集宁012000；4.中国疾控中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室，北京102206；5.解放军军事医学科学院军事兽医研究所，长春130122

R378.5

A

1002-2694(2016)07-0618-05

2016-01-13；

2016-06-20

DOI：10.3969/j.issn.1002-2694.2016.07.006

内蒙古卫计委医疗卫生科研项目(No.201301094)资助