微卫星标记对4个贵州地方牛品种遗传多样性研究

杨红文，韩勇，刘镜，肖礼华，粟朝芝

(贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

微卫星标记对4个贵州地方牛品种遗传多样性研究

杨红文，韩勇，刘镜，肖礼华，粟朝芝

(贵州省畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

选用联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的23对微卫星引物，采用荧光标记－多重PCR技术，检测了4个贵州地方黄牛品种的遗传多样性。结果显示，关岭牛和思南牛之间遗传距离最小，黎平牛和思南牛之间遗传距离最大;贵州4个地方黄牛品种两两间基因型一致的概率在关岭牛和思南牛之间的概率最大(2.892×10－23)，在黎平牛和思南牛之间的概率最小(1.001×10－24);贵州地方黄牛品种71.3%的遗传分化发生在品种间，28.7%的遗传变异发生在品种内。贵州地方黄牛品种遗传多样性程度较高，开展品种选育的选择潜力较大。

地方黄牛品种;微卫星;遗传多样性

开展畜禽品种遗传多样性和遗传分化的分子评估，为畜禽的品种分类、保护和开发利用提供科学依据，有利于保护畜禽的优良特性和选育出能适应环境、疾病和市场需求的新品种，对促进畜牧业可持续发展具有重要的意义［1～8］。

目前关于贵州黄牛品种遗传多样性和遗传分化在分子水平的评估研究仅有少量文献报道。在基于微卫星DNA分子标记的研究方面，李荣岭等［3］利用微卫星DNA分子标记对黎平黄牛与省外及国外11个黄牛品种进行了群体遗传多样性和遗传结构研究，研究结果表明，黎平黄牛遗传多样性较丰富，与恩施黄牛的遗传距离较近。王均辉等［7］用同样的方法研究了威宁黄牛、务川黑牛与省外及国外10个黄牛品种的群体遗传多样性，结果显示，威宁黄牛、务川黑牛的平均杂合度较高，遗传多样性较丰富，选择潜力较大。除这些比较初步的研究之外，未见其它文献报道。在基于mtDNA分子标记的研究方面，何正权等［2］和Yu Y等［9］利用15种限制性内切酶水解贵州黄牛的mtDNA并分析了其遗传多样性，发现贵州黄牛遗传多样性丰富，有普通牛类型和瘤牛类型的mtDNA分子，两者的频率分别是44.07%和55.93%。刘若余等［5］采用测序法对贵州黄牛mtDNA D－loop的遗传多样性进行了研究，结果表明，贵州黄牛有普通牛和瘤牛2大母系起源，其mtDNA遗传多样性比较丰富。林瑞意等［4］采用测序法研究了贵州务川黑牛mtDNA Cytb基因的遗传多样性，发现务川黑牛的Cytb基因的遗传多态性较为丰富，务川黑牛有普通牛和瘤牛2大母系起源。除这些研究之外，未见其它文献报道。总体来说，迄今在分子水平对贵州黄牛品种遗传多样性和遗传分化的研究较少，能提供的遗传学数据不多。本研究选用联合国粮农组织(FAO)和国际动物遗传学会(ISAG)推荐的23对微卫星引物，采用荧光标记－多重PCR技术，检测了4个贵州地方黄牛品种的遗传多样性。

1 材料和方法

1.1 材料本研究中4个牛品种血样的采集地及采集数量见表1。每个牛品种随机采集约60头，其中公牛不少于10头。要求采样个体具备品种的典型特征，并且在3代或2代内没有血缘关系。采用前腔静脉采血，每头牛采血量10 mL。新鲜血液用1∶1的裂解液(100 mmol/L Tris－HCL、100 mmol/LEDTA、2%SDS)裂解，常温下即可运输，－20℃长期保存。

表14 个牛品种名称及采样情况

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取:血液DNA提取采用常规酚氯仿抽提法。Taq酶、10×buffer均购自宝生物工程(大连)有限公司，dNTPs购自上海生工生物工程技术服务有限公司，POP4胶、甲酰胺等电泳检测试剂均使用美国应用生物系统公司进口试剂。提取出的基因组DNA首先经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测合格，然后用生物分光光度计将其浓度调整为20～50 ng/μL后即可进行PCR扩增。

1.2.2 多重PCR扩增:根据联合国粮农组织(FAO)推荐的引物，选取其中12对微卫星引物:CSSM014、CSSM016、CSSM022、ETH3、ETH10、ETH225、BM1818、BM1824、BM2113、TGLA122、TGLA126、TGLA227、MGTG7、TGLA48、TGLA53、TGLA263、SPS113、SPS115、GSSM036、MGTG4B、TGLA57、TGLA73、AGLA293，引物信息见FAO网址(http://www.fao.org)。上游引物5端标记荧光，根据各引物的序列、复性温度、目的片段大小，将引物有机组合进行扩增，分别对引物浓度、Mg2+浓度、复性温度、循环次数进行优化，取得最佳的扩增效果。

PCR反应体系为:2.5 μL MgCl2，2.5 μL dNTP(2 mM)，2.5 μL 10×缓冲液，上下游引物各1 μL，1 μL TaqE(1 U/μL)，1 μL DNA，13.5 μL dH2O，总体系为25 μL。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min;94℃变性50 s，退火50 s(退火温度视引物而定)，72℃延伸50 s，共35个循环;最后72℃延伸10 min。

1.2.3 PCR产物检测:PCR产物扩增成功后，采用ABI3100－Avant全自动基因分析仪进行检测，微卫星基因型用仪器自带软件Gene Mapper Vers ion 3.2进行分析。

1.2.4 统计分析:用POPGENE1.32软件(http://www.ualberta.ca/～fyeh/)计算平均等位基因数、有效等位基因数等参数，以及以等位基因频率为基础的杂合度和多态性信息含量。

2 结果

2.1 微卫星座位的等位基因变异在同一微卫星座位上等位基因数目和频率的差异可以反映出家畜品种内和品种间的差异，等位基因变异见表2。观测等位基因数量在3～14之间;CSSM014座位的观测等位基因数最多，达到14个;TGLA126和TGLA57座位的观测等位基因数最少，只有3个;同一位点观测等位基因数在群体间约有不同。有效等位基因数在在关岭牛、思南牛、威宁牛和黎平牛中的范围分别为1.62(MGTG4B)～8.46(TGLA227)、2.14(GSSM036)～7.05(CSSM022)、1.64(TGLA57)～7.11(TGLA227)、1.38(TGLA57)～6.17(TGLA227)。平均等位基因数在思南牛中最高(3.93)，黎平牛中最低(3.40)，关岭牛和思南牛则分别为3.75、3.66。

2.2 多态信息含量及平均遗传杂合度4个牛品种的多态信息含量、平均遗传杂合度见表2。思南牛、关岭牛、威宁牛、黎平牛平均杂合度分别为0.71、0.69、0.69、0.65，与有效等位基因数反映出的情况一致。23个微卫星多态信息含量在0.38(TGLA57)～0.84(TGLA227)之间，高度多态位点21个，中度多态位点2个，无低度多态位点。

表223 个微卫星位点在贵州4个牛品种中的特征

续表2

2.3 遗传距离通过3种途径估算的遗传距离见表3。Nei’s最小遗传距离在0.017 9～0.036 4之间，Nei’s标准遗传距离在0.117 8～0.061 8之间，Nei’s最大遗传距离在0.068 6～0.078 1之间。3种不同遗传距离估算方法获得的结果均显示，关岭牛和思南牛之间遗传距离最小，黎平牛和思南牛之间遗传距离最大。

表34 个品种两两间的遗传距离

3 讨论

3.1 群体内遗传变异

3.1.1 多态信息含量(PIC)是衡量标记多态性较好的指标。Botstein等提出了衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标:当PIC＞0.5时，为高度多态位点;当0.25＜PIC＜0.5时，为中度多态性位点;PIC＜0.25时，为低度多态位点［10］。研究结果表明，本实验所选的23个微卫星全部为高度多态位点，可作为有效的遗传标记用于贵州牛品种间遗传多样性分析。

3.1.2遗传杂合度是度量群体遗传变异的一个较合适的参数。本研究结果表明:思南牛、关岭牛、威宁牛、黎平牛平均杂合度比较高，分别为0.71、0.69、0.69、0.65，说明大部分所研究的中国地方黄牛的遗传多样性较高。

3.2 群体间遗传变异Nei等通过计算机模拟对各种遗传距离进行研究，证明在分析物种内群体间的遗传变异时，通过最小遗传距离、标准遗传距离、最大遗传距离3种途径估算的遗传距离最能反映出群体间变异实际情况［11～15］。本研究3种不同遗传距离估算方法获得的结果均显示，关岭牛和思南牛之间遗传距离最小，黎平牛和思南牛之间遗传距离最大。

［1］谷继承，刘丑生，刘刚，等.牛遗传资源分子遗传多样性的研究进展［J］.中国畜牧兽医，2010，37(9):127－130.

［2］何正权，张亚平，筒承松，等.贵州黄牛品种间mtDNA的限制性片段长度多态性研究［J］.动物学研究，1999，20(1):7－11.

［3］李荣岭，张桂香，王志刚，等.微卫星标记对12个中外牛品种群体遗传分化的研究［J］.遗传，2007，29(12):1463－1470.

［4］林瑞意，杨胜林，徐龙鑫.贵州务川黑牛mtDNA Cytb基因遗传多样性研究［J］.云南农业大学学报，2010，25(5):622－625.

［5］刘若余，夏先林，雷初朝，等.贵州黄牛mtDNA D－loop遗传多样性研究［J］.遗传，2006，28(3):279－284.

［6］马月辉，曹红鹤，陈幼春，等.部分黄牛品种(群体)遗传多样性分析［J］.中国农业科学，2003，36(6):696－699.

［7］王均辉，昝林森，张桂香，等.中国9个南方黄牛品种和3个引进品种的遗传多样性分析［J］.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2008，36(3):1－7.

［8］张桂香，郑有民，王志刚，等.我国部分黄牛品种线粒体D－loop区遗传多样性与起源分化［J］.遗传，2009，31(2):160－168.

［9］Yu Y，Nie L He ZQ，et al.Mitichondrial DNA variation in cattle of south China:origin and introgression［J］.Animal Geneties，1999(30):1－6.

［10］DE－XING ZHANG，GODFREY M.HEWITT.Nuclear DNA analyses in genetic studies of populations:practice，problems and prospects［J］.Molecular Ecology，2003(12):563－584.

［11］Ginja C，Penedo MC，Melucci L，et al.Origins and genetic diversity of New World Creole cattle:inferences from mitochondrial and Y chromosome polymorphisms［J］.Anim Genet，2010(41):128－141(a).

［12］Ginja C，Telo Da Gama L，Penedo MC.Analysis of STR markers reveals high genetic structure in Portuguese native cattle［J］.J Hered，2010，101(2):201－210(b).

［13］M.Sodhi，M.Mukesh，S.P.S.Ahlawat，et al.Genetic diversity and structure of two prominent zebu cattle breeds adapted to the arid region of india inferred from microsatellite polymorphism［J］.Biochem Genet，2008(46):124－136.

［14］Susana DUNNER，Nuno FERRAN，David GARCIA，et al.Genetic diversity measures of local European beef cattle breeds for conservation purposes［J］.Genet.Sel.Evol.2001(33):311－332.

［15］Catarina Ginja，Maria CT Penedo，Maria F Sobral，et al.Meseoarlceh.Molecular genetic analysis of a cattle population to reconstitute the extinct Algarvia breed［J］.Genetics Selection Evolution，2010(42):18

Analysis of the Genetic Diversity of 4 Guizhou Cattle Breeds Using DNA Microsatellite Markers

Yang Hongwen，Han Yong，Liu Jing，Xiao Lihua，Su Chaozhi
(Guizhou Institue of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Guiyang Guizhou 550005，China)

The genetic diversity of 4 Guizhou cattle breeds were analyzed using 23 microsatellie DNA markers recommended by the Food and Agriculture Organization of the United Nations(FAO)and the International Society of Animal Genetics(ISAG)through fluorescence－multiple PCR.The results showed that 4 breeds(Sinan，Guanling，weining and Liping cattle)mean heterozygosity(H)were 0.71、0.69、0.69 and 0.65 respectively，23 microsatellie polymorphism information content(PIC)were 0.38 to 0.84.The result may provide an academic basis for preservation and utifizationg of Guizhou native cattle breeds.

Native Cattle Breeds;Microsatellite;Genetic Diversity

S823.2:Q75

A

1007－1474(2016)05－0005－05

2016－07－11

贵州省自然科学基金(黔科合J字［2011］2224号)

杨红文(1979—)男，高级畜牧师，研究方向:分子遗传学与动物育种。