一株鸡多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏实验

徐雨，冯明祥，韦登雄，陈颖，刘苹，杨和俊，陈永翠

(贵州省关岭县动物疫病预防控制中心，贵州 关岭 561300)

一株鸡多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏实验

徐雨，冯明祥，韦登雄，陈颖，刘苹，杨和俊，陈永翠

(贵州省关岭县动物疫病预防控制中心，贵州 关岭 561300)

为确诊贵州省安顺市某土鸡养殖场暴发的疫病，无菌挑取病鸡的心、肝、脾和全血分别接种至血琼脂平板、TSA平板和麦康凯琼脂平板进行细菌培养，分离菌经革兰氏染色、生化实验，PCR鉴定、药敏实验和动物致病性实验。结果:分离菌为多杀性巴氏杆菌，该菌对庆大霉素、米诺环素中度敏感，对环丙沙星、诺氟沙星等其他药物不敏感。结论:实验成功分离鉴定了一株鸡多杀性巴氏杆菌。根据药敏实验指导该场用药后，疫情得到控制。

多杀性巴氏杆菌;分离;鉴定;药敏实验

禽霍乱是由多杀性巴氏杆菌引起禽的接触性烈性传染病［1］，临床症状主要有病鸡精神沉郁，排出绿色或白色稀粪，呼吸困难等，发病急，发病率、死亡率高，广泛分布于世界各地［2］。本文对安顺市某土鸡养殖场暴发疫病的病鸡进行细菌分离鉴定、PCR鉴定、动物性致病实验等，以期确定病原，同时通过药敏实验为该场用药进行指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及发病情况:2015年5月，安顺市某土鸡养殖场8 000只180日龄土鸡发病，少部分病鸡流涎，排绿色稀粪，无其他明显症状。有的正常吃食，站立时突然死亡。病鸡发病7天，共死亡1 800只，死亡率22.5%，饲料拌喂环丙沙星、硫酸粘菌素、恩诺沙星、硫酸新霉素和青霉素等药物，未能控制病情。

1.1.2 试剂:血琼脂培养培养基、TSA培养基、麦康凯培养基、PCR MIX、DNA marker(Biomiga)、药敏纸片、生化试管，均购于杭州微生物试剂有限公司(批号:20150907)。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌分离:无菌采集病鸡心、肝、脾和全血分别接种血琼脂平板、TSA和麦康凯平板，37℃培养24 h观察菌落生长情况。挑取单个菌落划线接种TSA平板，37℃培养24 h后，对分离菌进行革兰氏染色镜检。

1.2.2 生化试验:对分离菌进行氧化酶和厌氧葡萄糖管发酵实验，取非发酵细菌生化鉴定生化管，置37℃培养24 h，观察结果。

1.2.3 PCR实验:挑取单菌落接种于5 mL TSA培养液中，过夜培养，1 000 r/min离心菌液，ddH2O洗涤2次，煮沸法提取DNA。引物及PCR反应条件参照相关文献［3］，观察结果。

1.2.4 药敏实验:将分离纯化的细菌接种于TSB培养基中，置于37℃恒温摇床培养18 h，用0.9%NaCl做10倍稀释梯度稀释，稀释度为10－6、10－7、10－8，每个稀释度的菌液分别吸取1 mL均匀涂布于3个TSA平板，37℃恒温培养18 h后，统计每个平皿中菌落总数。将计数后菌落按1×10－8CFU/mL均匀涂布在2个TSA平板中，每个平板滴加0.1 mL菌液，用涂抹棒涂匀，用无菌镊子将庆大霉素等10种常用抗菌药物的药敏纸片紧贴于琼脂表面，置37℃恒温箱内18 h，观察结果。

1.2.5 动物致病性实验:将分离纯化的细菌接种于TSB，置于37℃恒温摇床培养18 h，将计数后的菌液做10倍稀释梯度稀释。取21日龄健康雏鸡18只，分为6个组，每组3只。1～5组分别肌肉注射10－1、10－2、10－3、10－4、10－5稀释TSA菌液，每只0.1 mL。第6组腹腔接种等量的灭菌生理盐水作对照组。分别隔离饲养观察，死亡后剖检观察病理变化，无菌采集肝脏病样划线接种于TSA平板，37℃恒温培养18 h，观察结果。

2 实验结果

2.1 样品解剖剖检病鸡可见胸腔积液，腹水;肝脏有白色坏死点;心包粘连、积水，心脏有白色坏死点;十二指肠有出血点;喉管出血。无菌采集病鸡心、肝、脾和全血。

2.2 细菌分离从心、肝、脾和全血中分离出形态大小一致的单一菌落，在血琼脂平板、TSA平板中的菌落形态为针尖大小、灰白色、露珠状小菌落，无溶血现象(见图1);在麦康凯平板中无菌落生长。经镜检为革兰氏阴性菌(染色呈红色)，呈球杆或短杆状。

图1 TSA平板菌落生长特征

2.3 生化试验从表1可以看出，硝酸盐、靛基质、蔗糖、木糖、葡萄糖和氧化酶为阳性;厌氧葡萄糖发酵、精氨酸、鸟氨酸等为阴性。鉴定编码为02253，即多杀性巴氏杆菌。

表1 生化鉴定结果

2.4 PCR鉴定结果PCR电泳结果显示条带大小在450 bp左右，与预期大小一致，阴性对照无条带(见图2)。

图2 PCR电泳结果

2.5 药敏实验菌落计数结果:菌液含量为1.97×108CFU/mL。按1×108CFU/mL涂布于平板中，结果见表2，分离出的多杀性巴氏杆菌对庆大霉素、米诺环素中度敏感，对其他药物不敏感。

2.6 动物致病性实验1、2组雏鸡于24 h内全部死亡，3组于24～48 h死亡1只，死亡雏鸡剖检可见肝脏表面有明显灰白色坏死点，部分鸡心脏有出血点;4、5组雏鸡饲养3天全部存活，剖检无病理变化;注入无菌生理盐水的对照组雏鸡饲养3 d后全部存活，剖检无病理变化。从死亡鸡肝脏无菌接种菌至TSA平板中，分离菌与感染菌株形态特征、染色镜检结果一致。

表2 药敏实验结果判定标准及结果

3 小结与讨论

通过对病鸡的心、肝、脾和全血进行细菌分离、纯化培养、染色镜检、生化试验和PCR鉴定，结果显示分离菌株为多杀性巴氏杆菌。动物致病性实验表明，从接种死亡鸡的肝脏中能回收到接种菌，说明多杀性巴氏杆菌为该场鸡群死亡的主要病原菌。药敏实验表明该菌对庆大霉素、米诺环素中度敏感，对其他常用于治疗禽多杀性巴氏杆菌病的药物耐药，推测该场长期使用环丙沙星等多种抗生素药物，导致此病菌株耐药性较高，该场用庆大霉素饮水给药1周后开始好转，疫情得到控制。随着抗生素药物的广泛应用，在动物饲养过程中长期使用一种或多种抗生素，导致多重耐药菌株出现［4］。一旦暴发疫病，药物治疗效果不佳，且造成的经济损失严重，因此规模化饲养需重视抗生素的合理使用。

［1］Swayne D E，Glisson J R，Mcdogald L R，et al.Diseases of Poultry［M］.13th ed.Ames，Iowa，USA and Oxford，UK:Wiley－Blackwel，2013:807－823.

［2］廖素环，韦天超，骞慧，等.一起火鸡禽霍乱的诊治［J］.养禽与禽病防治，2011(8):36－37.

［3］闫瑞雪，罗青平，汪辉，等.禽多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的初步建立［J］.湖北畜牧兽医，2015，36(2):5－7.

［4］幺乃全，李斯齐，邸海洋，等.火鸡多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及致病性研究［J］.中国兽医科学，2016，46(2):242－246.

Isolation，Identification and Drug Susceptibility Test of An Avian Pasteurella Multocida

Xu Yu，Feng Mingxiang，Wei Dengxiong，Chen Ying，Liu Ping，Yang Hejun，Chen Yongcui
(Guanling County Center of Animal Disease Control and Prevention，Guanling Guizhou 561300，China)

In order to determine the main pathogenic bacteria types which lead the death of an avian farm in anshun，Guizhou province.The heart，liver and spleen of avian was inoculated in avian blood nutrient agar plate，TSA plate and general nutrition agar plate respectively，from which then was isolated and purified.Dased on gram stain，biochemical test，PCR test，drug susceptibility test and pathogenic experiments on animals，the results showed that the isolated bacteria was Pasteurella multocida，which was medium sensitive to gentamicin and minocycline，but was not sensitive to ciprofloxacin，norfloxacin and so on.Conclusion:the experiment was successfully isolated an avian Pasteurella multocida.According to the result of the drug susceptibility test，the ill avian was controlled and recovered.

Pasteurella Multocida;Isolation;Identification;Drug Susceptibility Test

S858.31

B

1007－1474(2016)05－0016－03

2016－07－26

关岭自治县科技计划项目

徐雨(1989—)，女，主要从事畜牧兽医技术推广工作。

E－mail:893248907@qq.com