高效液相色谱柱的管理、维护、再生及修复技术

陈锡龙

(贵州省兽药饲料监察所，贵州 贵阳 550003)

高效液相色谱柱的管理、维护、再生及修复技术

陈锡龙

(贵州省兽药饲料监察所，贵州 贵阳 550003)

为加强和规范高效液相色谱柱的管理和维护，延长色谱柱的使用寿命，提高检测分析的工作效率，文章对高效液相色谱柱的实验室规范性管理进行了探讨。首先对色谱柱类型作了简要介绍，从流动相、样品及固定相3个方面详细分析了影响色谱柱使用寿命的原因。再从色谱柱档案的建立、分类存放、领用、启用、柱效评价、故障判断、适用范围信息积累、维护和再生、修复以及报废共10个方面建立了色谱柱实验室管理工作的一般流程。

高效液相色谱柱;管理;维护;再生;修复;技术

高效液相色谱法(HPLC)是20世纪60年代末期发展起来的新型分离分析技术［1］。液相色谱法是指流动相为液相的色谱技术，在经典的液相色谱法基础上，引入气相色谱法理论，在技术上采用了高压输液泵、高灵敏度的检测器和高效微粒固定相，实现了分析速度快、分析效率高和操作自动化，具有高压、高速、高效和高灵敏度等特点。其工作原理是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相系统泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入供试品，由流动相带入色谱柱，在柱内各成分被分离后依次进入检测器，色谱信号由记录仪、积分仪或色谱工作站记录［2］，通过对色谱信号数据信息的处理，从而实现对样品的定量及定性分析。高效液相色谱柱是高效液相色谱仪的心脏［3］，在高效液相色谱仪的使用中，保持色谱柱的柱效、容量和渗透特性，延长色谱柱的使用寿命非常重要。色谱柱使用一段时间后会出现柱升高、柱效降低、峰形崎变和分离度降低、保留时间改变等变化，如不采取措施，将会缩短色谱柱的使用寿命，影响工作效率，并造成一定的经济损失。因此，有必要加强和规范色谱柱的管理和维护，同时，也需要了解和掌握一些基本的色谱柱再生和修复技术，从而极大地延长色谱柱的使用寿命，提高检测分析的工作效率。

本文从高效液相色谱柱管理的角度，以HPLC法在检测分析中的实践活动为基础，以规范色谱柱的使用和维护，保证高效液相色谱分析的工作质量为出发点，从色谱柱档案建立、存放、领用、启用、柱效评价、故障判断、适用范围信息的积累、色谱柱的维护和再生、修复以及报废10个方面，探讨色谱分析实验室对于色谱柱的分类管理，摸索高效液相色谱柱有序、有效使用的管理方法，并建立了规范管理的一般工作程序。

1 色谱柱的类型

色谱柱有多种不同的分类方法，根据固定相极性的不同可分为极性色谱柱和非极性色谱柱;根据固定相和流动相的相对极性的不同可分为正相色谱柱和反相色谱柱;根据色谱柱填充剂的差别可分为硅胶柱、化学键合硅胶柱、离子交换树脂柱、凝胶柱、玻璃微球柱等。在化学键合硅胶柱中以十八烷基键合硅胶柱应用最广泛，辛基硅烷键合硅胶柱次之，即通常所说的C18和C8柱，胺基柱、腈基柱和苯基柱也偶有使用。

2 影响色谱柱使用寿命的因素

2.1 流动相用作流动相的溶剂应与固定相不互溶，并能保持色谱柱的稳定性;所用溶剂应有高纯度，以防所含微量杂质在色谱柱中积累，引起柱性能的下降。以水溶液为流动相时，水溶液中的微生物(例如细菌、藻类和霉菌等)极易生长繁殖，这些微生物可能会堵塞固定相颗粒间的空隙，所以纯水溶液流动相在室温下最多使用时间不能超过48小时，如果需要短期保存，可以加入5%～10%的乙腈、甲醇等有机溶剂。目前普遍使用的色谱柱填料直径一般都小于10 μm，流动相中的细小颗粒杂质很容易先沉积在柱头然后慢慢堵塞柱子。流动相的pH值对色谱柱也有影响，特别是对化学键合硅胶填料，水溶液的pH值最适范围在2.0～8.0之间，当pH＞8.5时会引起基体硅胶溶解，并生成絮状物堵塞柱子。当pH＜1.0时，键合的硅烷会被水解并从柱中洗脱下来。这两种情形造成的损坏很难复原，柱效会很快下降甚至完全失效。当缓冲液中加入有机溶剂(例如甲醇或乙腈)时，盐类的溶解度下降，会析出盐沉淀堵塞柱子。同时，流动相中的有机溶剂和盐会腐蚀色谱柱柱头上的筛板，产生柱头凹陷。流动相的极性对柱子也有影响，对于硅胶柱，甲醇、水、冰乙酸等极性较大的物质会破坏填料;反之，对于化学键合硅胶柱，极性小的物质(如正丁醇、二氯甲烷等)也起到破坏作用。碱性溶液会破坏阳离子交换树脂色谱柱，酸性溶液则会破坏阴离子交换树脂柱。

2.2 样品由于被分析样品种类繁多，加之样品基质复杂，色谱柱极易被污染，是导致柱压升高、分离效能下降的原因之一。通常，样品中含有一些对分析不利的物质，这些非目标物能够被检测器检测到而形成色谱峰、气泡、基线漂移或负峰。其中保留值弱的物质，一般能快速从色谱柱洗脱出来，对分析不产生干扰;中等保留强度的杂质能被缓慢冲洗出来，可对分析产生一定的干扰;强保留杂质通常难以被洗脱，多次上样后，聚集在柱头或色谱柱中，有的分析物甚至可能在通过色谱柱时与固定相发生作用，这些被吸附的杂质累积到一定程度后会形成新的伪固定相，从而改变色谱柱的性能。对于基质复杂的样品，1根色谱柱的使用寿命可能只有百余次，而且每种色谱柱适用的样品有限，1次错误的进样甚至可能导致色谱柱失效［4］。

2.3 固定相生成硅胶材料的纯度、微量金属的含量、硅醇基的活性，都可能影响硅胶固定相的色谱行为(如不同色谱柱之间和不同批号产品之间的重复性)，其中硅胶表面的硅醇基在色谱行为中起着关键作用。硅胶表面的硅醇基与碱性化合物反应可导致峰形拖尾和色谱分离度的损失。硅胶中含有的痕量金属杂质，是引起色谱峰形拖尾和柱效损失的另一个因素。样品中的一些组分还会同固定相产生反应，特别是胺基柱表现最为明显，因为胺基易与醛、酮的羰基反应形成席夫(Schiff)碱而减少活性点，使样品的保留时间缩短。因此，胺基柱不能用于分析含羰基的化合物(如甾酮、还原糖等)［5］。色谱柱键合相基团脱落、固定相分解和活性基团变性等会影响柱效并使保留时间发生显著改变。大多数键合相都是通过硅氧硅键连接在硅胶基质上，形成带有有机基团的固定相，硅氧硅键可能在水溶液中水解断裂，从而使键合基团脱落。

3 高效液相色谱柱的管理

3.1 色谱柱档案的建立色谱柱应统一编号，并建立纸质和电子版档案，色谱柱信息应尽可能填写完备以便建立色谱柱的适用信息的积累。内容包括:色谱柱编号、生产厂家、品牌、填料、型号、规格、运输中的溶剂、最大耐压、最大流速、使用温度、pH范围、注意事项、序列号、购进时间、单价、备注等。色谱柱使用信息可参照色谱柱包装内的说明书或官方网站提供的相关说明。

3.2 色谱柱分类存放不同类型的色谱柱应分类存放以方便管理。硅胶柱、化学键合硅胶柱、氰基柱或胺基柱、离子交换树脂柱、凝胶柱各用1个专用色谱柱盒存放，盒上贴标签，注明类别。随柱说明书装入密封袋附在登记本上。每启用1根色谱柱，在色谱柱上贴上标签，注明启用日期。对于已经失效的色谱柱，经质量管理员评估后认为确需报废的应做好报废记录。报废后的色谱柱不能随意丢弃，应专门存放。如果在用色谱柱需要进行修复，可以使用报废柱的填料填充。

3.3 色谱柱领用检验员根据需要向色谱柱管理员申请领用色谱柱，色谱柱管理员应在电子档案上登记领用日期、领用人及归还日期以便追溯。

3.4 色谱柱的启用首次启用色谱柱时应记录并妥善保存使用新色谱柱时的基本信息及各项性能指标，以便为以后进行柱效评价提供参考依据。记录使用新色谱柱时的基本信息包括色谱柱、测试样品的基本信息及测试条件3个方面的内容。色谱柱的基本信息应记录:色谱柱的序列号、品牌名称、规格型号、死体积等。测试样品基本信息主要记录:样品名称、含量、进样体积等。测试条件记录:流动相名称及比例、检测波长、流速、柱温、柱压等。色谱柱性能指标主要记录:容量因子、峰面积、峰高、峰宽、对称因子用理论塔板数等。首次启用新色谱柱时建议用其对比较稳定的标准样品进行分析。记录测试条件和譔色谱柱各项性能指标，有利于以后进行平行比较，评价色谱性能变化。例如某次启用某一新色谱柱时所记录的基本信息及其性能指标为:(1)色谱柱基本信息:品牌:Agilent;型号:ZORBAX SB－C18;系列号:USCL056891;长度:250 mm;内径:4.6 mm;粒径:5 μm;死体积:60.0%。(2)测试样品:阿莫西林对照品;含量(浓度):0.447 5 mg/mL(折合净含量);进样量:20 μL;测试时间:20151126。(3)测试条件:流动相:0.05 M KH2PO4(用磷酸调节pH至5.0)－乙腈=97.5︰2.5;检测波长:254 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;压力:97 Bar。(4)性能指标:容量因子(k’):4.85;峰面积:142 6.75;峰高:102.33;对称因子:1.12;峰宽:0.212 2;理论板数:9 433。

3.5 柱效评价所谓柱效评价就是考察色谱柱在使用前及使用过程中的各项性能指标，充分了解其分离能力的变化情况，以便顺利完成分析测试任务。液相色谱柱的性能指标包括在一定实验条件下的柱压、理论塔板数、容量因子、对称因子和相邻组分的分离度等。新购色谱柱包装内一般均附有出厂时色谱柱柱效评价报告，一般采用尿嘧啶、领苯二甲酸甲酯、二苯胺、萘、芴［6］、苯酚、硝基苯、甲苯等几种化合物作为混合标准品，考察几种物质的容量因子、理论板数、分离度、拖尾因子等。色谱柱使用一段时间后，也应对色谱柱的柱效进行评价。可采用上述几种物质中的数种作混标溶液进行评价，也可以采用经常检验的性质较稳定的样品进行评价，记录色谱图和相关信息。内容应包括:色谱柱序列号、测试样品名称含量、测试条件、柱效、使用日期、备注等。了解新色谱柱的各项性能指标，方便以后进行平行比较，评价色谱柱的性能变化。使用常检样品对色谱柱进行柱效评价是一个实用且便利的方法，但是对于缺少前期实验数据的色谱柱，则宜采用规范的混合标准物质进行评价。比较直观的方法是考察峰高、峰宽及峰形拖尾的情况，最简单而有效的方法是考察理论塔板数的下降情况。一般理论板数下降50%时应及时对色谱柱进行再生处理［7］。

3.6 色谱柱故障判断在检验中发现，色谱柱柱效下降体现在色谱图上主要表现为6种峰形，分别为峰形加宽变形、峰形变粗、严重拖尾、出现肩峰、峰尖分叉(双峰)及峰形畸变，分别见图1～图6。一般而言，前3种情形受到污染的情况比较轻微，经过再生即可大大提高柱效。出现第4种峰形一般是由于色谱柱受污染较为严重，如果是发生在初期，通过再生清洗也能够恢复大部分柱效，如果长时间未进行处理，污染物与固定相已经牢固结合，则不能通过再生进行恢复，而只能通过清除被污染的固定相来进行修复了。出现第5种峰形一般是色谱柱柱头塌陷所致。第6种情形是本应为单一的色谱峰却畸变为多个色谱峰，这是污染非常严重造成的。柱头塌陷和严重污染均不能通过再生恢复柱效，只能通过物理方法进行修复。

图1 峰形加宽变形色谱图

图2 峰形变粗色谱图

图3 峰形严重拖尾色谱图

图4 出现肩峰色谱图

图5 峰尖分叉(双峰)色谱图

图6 峰形畸变色谱图

3.7 色谱柱适用范围信息积累由色谱柱管理员定期更新，并按照色谱柱品牌和型号进行分类整理，按照色谱柱类型、填料和采用的流动相对分析品种进行汇总分类，对于色谱柱不适用品种进行标注并分析原因，归纳总结。色谱柱适用范围信息的积累对于色谱柱的选择指导意义，能提高具体品种方法开发和分析的效率。

3.8 色谱柱的维护和再生

3.8.1 色谱柱应轻拿轻放，避免碰撞、振动和跌落;放置和归还时检测员应确认保存在合适的溶剂之中，并确认色谱柱两端的堵头已旋紧。经验表明，使用高级别的有机溶剂及实验用水对于维护色谱柱的性能具有关键性作用。高效液相色谱实验中所使用的有机试剂必须达到色谱纯级别;实验用水［8］须为GB/T 6682—2008或ISO 3696:1987，MOD规定的一级水，当实验室受条件限制不能自行制备一级水时，经验上的做法是可以使用娃哈哈公司生产的饮用纯净水替代。

色谱柱压力升高时，可采用下述方法处理:(1)使用比当前使用的流动相对样品溶解能力更强的试剂清洗色谱柱;(2)将色谱柱反向连接冲洗(反接色谱柱时，应确保色谱柱允许反接);(3)将色谱柱柱头的筛板拆卸超声清洗后再安装使用。

3.8.2 色谱柱的再生:当色谱柱出现峰高降低、峰宽加大等比较明显的柱效下降情况，特别是理论板数下降超过50%以上，或者出现肩峰影响定量计算结果时，应及时对色谱柱进行再生处理。色谱柱再生应在色谱柱档案中注明。再生原则如下:(1)反相柱的再生:采用甲醇∶水=95∶5(V∶V)，纯甲醇、二氯甲烷等溶剂作流动相，顺次冲洗，每种流动相经色谱柱的量为20～30倍柱体积，然后再用相反顺序冲洗色谱柱。(2)正相柱的再生:顺次用20～30倍柱体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷、甲醇作为流动相冲洗色谱柱，然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。由于异丙醇的黏度较大，冲洗时应将流速调到0.2 mL/min，以免柱压过大冲坏色谱柱。

3.9 色谱柱的修复当色谱柱出现柱头塌陷或严重污染无法进行再生时，可挖掉被污染部分的固定相(长度一般不超过2 cm，且绝大多数可从颜色上进行区分，被污染的固定相靠柱头端及柱壁部分一般呈黑褐色)，再重新填充同样的近干燥的固定相，用少量流动相湿润，再填充干燥的固定相与柱口齐平(必要时用光滑的不锈钢棒压紧)，如此重复3～5次。然后重新安装色谱柱，连接高压泵，用流动相冲洗并保持一定压力。可重复上述过程多次直至修复成功。色谱柱的再生和修复工作繁琐耗时且需要具备一定的专业技巧，建议应由专业的技术人员或者专门的服务机构来处理。

3.10 色谱柱的报废对于确已失效的色谱柱，经质量管理员评估后认为确需报废的应做好报废记录。报废后的色谱柱也应专门存放，以便将来可以利用其填料修复被严重污染的色谱柱。

4 小结

高效液相色谱柱是检测分析机构的宝贵资源，色谱柱的管理、维护、再生及修复技术在检测分析工作中具有举足轻重的作用。良好的管理、正确的维护能够提高色谱柱的使用效率，节约分析时间，而掌握一定的再生及修复技术则可以延长色谱柱的使用寿命，有利于降低检测分析的成本。

［1］于世林.高效液相色谱方法及应用:第2版［M］.北京:化学工业出版社，2005:1.

［2］谢虹，刘秋朝，梁建生，等.高效液相色谱柱的管理［J］.实验室研究与探索，2003，22(3):117－125.

［3］刘翻，熊志超，张凌怡，等.高效液相色谱柱清洗与再生方法［J］.分析测试技术与仪器，2010，16(2):71－77.

［4］郑伟，孙东方.高效液相色谱柱的选择、使用与维护［J］.口腔护理用品工业，2011，21(6):37－39.

［5］于世林.高效液相色谱方法及应用:第2版［M］.北京:化学工业出版社，2005:79.

［6］林兰，程奇蕾，宁保明，等.浅谈分析实验室高效液相色谱柱的管理［J］.中国药师，2014，17(11):1972－1973.

［7］于世林.高效液相色谱方法及应用:第2版［M］.北京:化学工业出版社，2005:314.

［8］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.分析实验室用水规格和试验方法［S］.北京:中国标准出版社，2008:1.

Technology of Repairing，Cleaning，Maintaining and Managing Chromatographic Column for HPLC

Chen Xilong
(Guizhou Provincial Supervisory Institute of Veterinary Drug and Feeds，Guiyang Guizhou 550003，China)

It is studied on standard management of chromatographic columns in a quality testing lab，referring to practical works in test and other people’s research，so that columns can be maintained properly and used much longer time.This article introduces classification of columns briefly at first，and then analyzed mobile phase，samples，and stationary phase that influence life－time of a column.A standard procedure is set up on how to register，store，get，use，maintain，clean，repair or discard a column，evaluate its performance，decide its conditions，or gather its usage information.

Technology;Repair;Clean;Maintain;Manage;Chromatographic Column;HPLC

O657.7

A

1007－1474(2016)05－0023－05

2016－07－15

陈锡龙(1969—)，男，高级兽医师，从事兽药质量检验检测及相关研究工作。E－mail:cxlofyjs@163.com