HBV不同感染状态患者CD4+T细胞功能的差异研究

张丹 李明慧 屈晓晶 靳丽 张璐 路遥 谢尧 刘顺爱 成军 华文浩 宋淑静

100015首都医科大学附属北京地坛医院肝病中心

HBV不同感染状态患者CD4+T细胞功能的差异研究

张丹 李明慧 屈晓晶 靳丽 张璐 路遥 谢尧 刘顺爱 成军 华文浩 宋淑静

100015首都医科大学附属北京地坛医院肝病中心

目的 探讨适应性免疫应答（adaptive immune response）中CD4+T淋巴细胞在不同HBV感染状态患者中功能的差异。方法 采集健康成人（hea1thy individua1s，HI）、急性乙型肝炎（acute hepatitis B，AHB）、慢性HBV感染免疫耐受期（immune to1erance phase，IT）和免疫清除期（immune c1earance phase，IC）患者的外周静脉全血。应用流式细胞术检测外周血CD4+T细胞频数，表面功能分子CD69表达，Th1、Th2亚群细胞频数及Th1/Th2比值，并分析其在HBV感染不同状态患者中的差异。结果 共收集健康人、急性乙型肝炎、慢性HBV感染免疫耐受期和免疫清除期患者各12、33、30、49例。急乙肝组CD4+T细胞频数（AHB，39.99±8.00%）显著高于免疫耐受组（IT，33.86 ±6.87%）和免疫清除组（IC，34.52±9.17%）（F=4.584，P=0.004），其余各组差异无显著性；急乙肝组的CD69分子的平均荧光强度（mean f1uorescence intensity，MFI）（25.56±9.01）也显著高于免疫清除组（21.66±3.38）和免疫耐受组（21.57±5.58）（F=3.291，P=0.023），而AHB、IC、IT、HI各组的CD69分子绝对分子数（abso1ute mo1ecu1ar count，ABC）依次降低，且差异均有统计学意义（F= 15.201，P=0.000）。HBV各感染状态的Th2/Th1比值均无显著性差异（1.76±0.54，1.57±0.59，1.76±0.67，P＞0.05）。结论 急性乙型肝炎患者的CD4+T细胞频数及细胞表面活化分子CD69均显著高于慢性HBV感染组；Th2型应答在HBV各感染状态的CD4+T细胞应答中均占主导地位。

【主题词】 肝炎；乙肝病毒；CD4+T淋巴细胞免疫耐受期；免疫清除期

Fund programs：Nationa1 Natura1 Science Fundation of China（NSFCNO.81071344），Beijing Science and Techno1ogy Commission Major Project（D121100003912001）乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）HBV是引起人类慢性肝脏疾病的一个重要原因，每年约有65万人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化、肝癌（HCC），我国肝硬化和HCC患者中，分别有60%和80%是由HBV感染引起［1］。由于机体遗传背景、免疫状况的差异，HBV感染后的临床转归也不同。大量研究已经证实肝脏炎症严重程度及病毒清除与特异性细胞毒性 T淋巴细胞（cytotoxic T 1ymphocyte，CTL）有关［2］，但是对于辅助型 CD4+T细胞在临床发病和转归中的作用并不是很清楚。本实验旨在对不同感染状态的HBV感染人群CD4+T细胞功能进行研究，探讨其与HBV感染临床转归的关系。

1 对象及方法

1.1研究对象 2014年9月至2016年1月到北京地坛医院就诊的急性乙型肝炎、慢性HBV感染免疫耐受期和慢乙肝免疫清除期患者及地坛医院健康职工的外周静脉全血。各组人群入组标准：慢性HBV感染免疫耐受组（IT）：年龄≤38岁，HBVDNA≥107拷贝/m1，HBeAg≥1200 S/CO，ALT≤30 U/L，半年以上未服用过保肝降酶药。急乙肝组（AHB）：诊断符合病毒性肝炎防治指南［7］。慢乙肝免疫清除期组（IC）：HBsAg阳性6个月以上，HBVDNA（+），HBeAg≥100 S/CO，ALT≥190 U/L，且至少有3个月以上的 ALT异常史。所有入组者排除 HIV、HCV、梅毒及其他感染性疾病。该研究经首都医科大学附属北京地坛医院伦理委员会审查通过，所有患者均签署知情同意书。

1.2标本采集 入组者新鲜EDTA抗凝静脉全血，4 h内上机检测。

1.3主要仪器及试剂 FACSCa1ibur流式细胞分析仪、荧光标记单克隆抗体（鼠抗人CD3-PercP、CD4-APC、CD69-PE、CD4-FITC、CD45RO-APC、CD62LPE）、QuantiBRITE PE微球和红细胞裂解液（FACS Lysing So1ution）均购自美国BD公司。

1.4流式细胞仪检测外周血CD4+T细胞分子频数及表面分子表达 细胞染色后BD FACS Ca1ibur上机，根据FSC、SSC设定淋巴细胞门，CD3-PercP （+）CD4-FITC（+）设定CD4+T细胞，并划分Th1 （CD45RO+CD62L-）、Th2（CD45RO+CD62L+）亚群；设定 CD3-PercP（+）CD4-APC（+）CD69-PE （+）群，并用F1owjo 7.6软件分析出细胞频率、平均荧光强度（Mean f1uorescence intensity，MFI），以QuantiBRITE微球制作标准曲线计算平均每个细胞表面功能分子 CD69的绝对分子数（Abso1ute mo1ecu1ar count，ABC）。

1.5统计学方法 应用SPSS 17.0软件进行统计分析，计数资料采用百分率表示，计量资料以均数±标准差（Mean±SD）表示。正态分布资料的四组间数据的比较采用方差分析完成，若四组间数据比较差别有统计学意义，则采用LSD方法进行两两比较，P＜0.05表示差别有统计学意义。

表1　入组患者基本信息Tab.1 Genera1 information of subjects in this study（Mean±SD）

表2　各组间CD4+T细胞亚群的细胞频数及功能分子比较（Mean±SD）Tab.2 The frequency of CD4+T and their surface functiona1 mo1ecu1es in different groups

图1　CD4+T细胞频数、各亚群频数、表面CD69活化分子表达在健康成人、慢性HBV感染免疫耐受期患者、急性乙型肝炎患者、慢性HBV感染免疫清除期患者中比较Fig.1 Comparison of CD4+T ce11 frequency、the subsets of CD4+T ce11 and the expression of ear1iest activation signa1s CD69 in hea1thy individua1s（HI），patients in the immune to1erance（1T），patients with acute hepatitis B（AHB）and patients in immune c1earance（IC）phase

2 结果

外周血CD4+T细胞频数，Th1、Th2亚群分布及表面分子CD69、IFNAR2表达如下：

2.1HBV各感染状态临床指标比较 AHB组的ALT显著高于IC、IT组（F=42.83，P=0.00），而HBVDNA，HBsAg，HBeAg显著低于IC、IT组（P= 0.00），差异均有统计学意义（表1）。

2.2HBV感染各组CD4+T细胞频数 急乙肝组CD4+T细胞频数（AHB，39.99±8.00%）较免疫耐受组（IT，33.86±6.87%）和免疫清除组（IC，34.52 ±9.17%）显著升高（F=4.584，P=0.004），其余各组无显著差异。（图1，表2）。

2.3Th1、Th2频数及Th2/Th1比值 HBV感染各组的Th2细胞频数（F=1.406，P=0.244）和Th2/Th1比值（F=5.464，P=0.01）差异无统计学意义，Th1显著高于健康成人组（F=4.469，P= 0.005）（图1，表2）。

2.4CD4+T细胞表面表达的CD69分子的平均荧光强度和绝对分子计数 急乙肝组的 CD69MFI （25.56±9.01）较免疫清除组（21.66±3.38）和免疫耐受组（21.57±5.58）明显升高（F=3.291，P= 0.023），AHB，IC，IT，HI各组的CD69分子的绝对分子数依次降低，差异均有统计学意义（F= 15.201，P=0.000）。（图1，表2）。

3 讨论

CD4+T细胞在适应性免疫应答中主要通过辅助型T细胞发挥免疫学效应，而Th细胞根据分泌细胞因子不同主要分为两个亚群（Th1和Th2），其中Th1细胞主要通过释放IL-2、IFN-γ等细胞因子，调节CTL细胞发挥细胞毒作用，介导细胞免疫，有利于自身病毒的清除，而Th2细胞主要分泌细胞因子IL-4、IL-6、IL-10等，表达协同刺激分子配体CD40L，结合B细胞表面CD40，调节体液免疫［3］，与肝脏炎症损伤有关。很多研究显示外周血中Th1/ Th2比例失衡，细胞免疫紊乱可能是导致HBV感染不能完全恢复的重要原因［4-5］。CD69是表达在活化的淋巴细胞表面的早期活化标志，当淋巴细胞受到抗原刺激时，CD69表达可上调，而Luisa Barboza a等的研究显示慢性HBV感染的患者CD4+T细胞的早期活化并不充分，体外以HBcAg刺激CD4+T细胞后表面的活化分子CD69是下调的，CD4+T细胞不能完全发挥作用，也许可以在一定程度上解释为何病毒在人体内持续存在［6］。

本研究结果显示，急性乙型肝炎组的CD4+T细胞频数及细胞表面的活化分子CD69均显著高于慢性HBV感染免疫清除和免疫耐受组，提示急性乙型肝炎患者CD4+T细胞水平的应答较慢性HBV感染者明显增强，同时显示不论在慢性HBV感染的免疫清除还是免疫耐受患者，HBV感染均可诱导CD4+T细胞的活化和活化分子CD69表达上调，这与Luisa Barboza a等的研究是相反的。但其上调水平有限，在免疫清除期会引起一定程度的肝脏炎症，不能达到与AHB相当的肝脏炎症，HBV感染自然也不能完全恢复，而免疫耐受期虽然也有CD4+T细胞应答，但可能由于长期在高载量HBVDNA、HBsAg和HBeAg诱导下，Treg细胞较急乙肝患者显著升高，CD4+T细胞表面抑制性受体（CTLA-4、PD-1等）及抑制性细胞因子（IL-10、TGF-β）表达上调，使宿主的免疫应答整体处于低能水平［7-9］。本研究结果还显示，三组HBV感染者Th2/Th1均大于1，AHB与IC组的Th2细胞频数高于IT组和HI组，IT、IC、AHB、HI四组Th1细胞频数呈下降趋势，但无显著性差异，可能与有限的入组例数有关。其中HI较其余三组明显下降，提示不论是急性还是慢性HBV感染的炎症期均以Th2应答为主，尤其是急性乙型肝炎早期，Th2分泌大量炎症因子，攻击HBV感染肝细胞从而引起的重度肝损伤，而Th1主要介导细胞免疫并不引起转氨酶升高，但其在急性乙型肝炎恢复期彻底清除病毒中发挥着重要作用。而慢性HBV感染者虽然也有Th2升高，但由于机体免疫功能不足，反复引起肝脏损伤，病毒不能彻底清除，从而使肝炎逐渐向肝硬化发展。

综上所述，CD4+T细胞频数和功能的改变在宿主的抗病毒免疫中发挥重要作用，Th2应答在HBV各感染状态的CD4+T细胞免疫应答中占主导地位。通过对免疫细胞的功能进行研究为我们在不同HBV感染状态选择合适的治疗手段提供了依据。

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CD4+T cell function of the patients in different states of HBV infection

Zhang Dan，Li Minghui，QuXiaojing，Jin Li，Zhang Lu，Lu Yao，Xie Yao，Liu Shunai，Cheng Jun，Hua Wenhao，Song Shujing Liver Center of Beijing Ditan Hospital，Capital Medical University，Beijing 100015，China

Xie Yao，Email：xieyao00120184@sina.com；Liu Shunai，Email：liusa1031@ sina.com

Objective To exp1ore the functiona1 differences of CD4+T 1ymphocytes in patients with different states of HBV infection.Methods Co11ect hea1thy adu1ts（HI），acute vira1 hepatitis（AHB），chronic HBV infection in immune to1erant phase（IT），and chronic hepatitis B in immune c1earance phase （IC）patients with venous b1ood.Use f1ow cytometry to detect periphera1 b1ood CD4+T frequencies，the expression of surface mo1ecu1e CD69，Th1 and Th2 subsets frequency and the ratio of Th1/Th2.and ana1yze the difference in different states of HBV infection.Results Co11ect 12，33，30，49 cases patients of HI，AHB，IT，IC respective1y.The frequency of CD4+T ce11s in the acute hepatitis B group（AHB，39.99± 8.00%）was significant1y higher than that in the immune to1erance group（IT，33.86±6.87%）and the immune c1earance group（IC，34.52±9.17%），（F=4.584，P=0.004），and there was no significant difference among the other groups（1.76±0.54，1.57±0.59，1.76±0.67，P＞0.05）.Acute hepatitis B group（25.56±9.01）increased significant1y in CD69MFI than in the immune c1earance group（21.66± 3.38）and immune to1erance group（21.57±5.58），In acute hepatitis B，immune c1earance，immune to1erance group and the group of hea1thy adu1ts，the CD69 mo1ecu1ar abso1ute number decreased in turn（F= 15.201，P=0.000）.Conclusions The frequency of CD4+T ce11s and the surface mo1ecu1e CD69 in patients with acute hepatitis B were significant1y higher than those in chronic HBV infection group；Th2 response was dominant in the CD4+T ce11 response to HBV infection.

Hepatitis B；hepatitis B virus；CD4+T 1ymphocytes；immune to1erance phase；immune c1earance phase

国家自然科学基金（81071344）北京市科学技术委员会重大项目（D121100003912001）

谢尧，Emai1：xieyao00120184@sina.com；刘顺爱，Emai1：1iusa1031@sina.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.02.019

2016-03-01）