一例猪伪狂犬病病毒的诊断

王　霞　福建省泉州市惠安县农林局　362100

一例猪伪狂犬病病毒的诊断

王霞福建省泉州市惠安县农林局362100

2015年11月，当地某养殖户15日龄仔猪出现角弓反张、精神沉郁等疑似猪伪狂犬病病毒感染的典型神经症状，但查看免疫程序，已免疫猪伪狂犬病疫苗（Bartha-k61株）。经gE基因血清学调查和针对gE基因的PCR诊断，证实该病例为猪伪狂犬病病毒感染所致。

猪伪狂犬病病毒感染gE基因诊断

猪伪狂犬病病毒 （porcine pseudorabies virus，PRV）属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、α-疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）、水痘病毒属（Varicellovirus）。PRV基因组为双股DNA，病毒全基因组长150 kb左右，病毒基因组中存在独特长（Unique long，UL）区和独特短（Unique short，US）区。研究发现PRV的GC含量超过70%，其UL区和US区序列在基因组中方向并不完全一致 （表现为同向和反向两种情况）［1-4］。在US区中存在PRV的一种主要糖蛋白gE，该蛋白是一种主要的猪神经性因子，促进细胞融合后导致PRV在动物机体有效扩散，现已证实该蛋白在PRV入侵血脑屏障和疾病传播中起到重要作用［5］。

当前，在我国猪群中广泛使用猪伪狂犬病病毒匈牙利弱毒株（Bartha-k61株）来防控PRV感染和传播，使得PR曾经在我国得到有效控制。对PRV疫苗株Bartha-k61株进行基因组序列测定发现，该株表现为gE基因缺失。基因缺失疫苗的出现，使PRV的血清学鉴别诊断成为可能。通过gE基因血清学鉴别诊断试剂盒，多国已启动PRV根除计划，使PRV在全球部分国家已得到根除。

1　材料与方法

1.1猪伪狂犬病病毒gE基因血清学诊断采集仔猪血液后，按照常规分离血清的方法小心分离猪血清。按照猪伪狂犬病病毒gE抗体诊断试剂盒说明书推荐的步骤进行血清学检测。

1.2猪伪狂犬病病毒gE基因病原学诊断

1.2.1病料采集和处理剖杀感染仔猪后，采集其肺脏、腹股沟淋巴结，研磨后反复冻融3次，4 000 r/ min离心20 min后，小心吸取上清备用。

1.2.2gE基因的扩增针对PRV的gE基因特征，利用分子生物学软件Oligo7设计引物。上游引物gE-1F：ATGACCTCAACGGCGACCTC；下游引物gE-1R：TCGCCCACCGCCACAAAGAACA。引物预期扩增片段大小为460 bp。本研究扩增采用动物组织直接扩增试剂盒，简要步骤如下：取试剂盒中的AD1试剂40 μL、AD2试剂10 μL，混匀后加入20 μL组织研磨液上清，继续混匀一次，55℃水浴10 min后94℃作用 5 min，待恢复室温后加入AD3试剂40 μL，混匀后作为PCR扩增的模板基因组DNA。PCR反应液的配置为，模板10 μL、上、下游引物（gE-1F/gE-1R，20 μM）各0.5 μL、2*PCR扩增试剂20 μL，补充灭菌去离子水至终体积40 μL。扩增反应条件为，94℃预变性10 min后进入循环，循环参数为94℃30 s、60℃30 s、72℃30 s，40个循环后，72℃延伸10 min。取PCR产物5 μL，进行常规琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.2.3基因序列测定和分析符合试验预期的电泳目的条带经胶回收试剂盒切胶回收后，将目的片段与T克隆载体连接。随机选取8个单菌落摇菌后提取相应的质粒进行PCR鉴定。PCR鉴定所使用的引物为gE-1F/gE-1R，扩增的目的片段大小仍为460 bp。该步PCR反应液的配置为，模板1 μL，上、下游引物（gE-1F/gE-1R，20 μM）各1 μL，2*PCR扩增试剂25 μL，补充灭菌去离子水至终体积50 μL，PCR扩增条件同上。将经PCR验证符合试验预期的重组质粒送由专业测序公司进行序列测定，并对测定的序列进行BLAST分析比较。

2　结　果

2.1猪伪狂犬病病毒gE基因血清学检测经酶标仪测定，样品OD450值为0.91。试剂盒阳性对照和阴性对照OD450值均符合试剂盒质控要求，表明仔猪的伪狂犬病病毒gE基因血清学检测结果为阳性，经查免疫程序发现，该猪已免疫猪伪狂犬病疫苗（Bartha-k61株），表明该猪群存在PRV感染。

2.2猪伪狂犬病病毒gE基因病原学检测

2.2.1PCR检测使用针对gE基因的引物 （gEF1/gE-R1）进行PCR扩增，结果表明，PCR扩增产物琼脂糖凝胶上靠近500 bp条带附近出现特异性条带，与扩增的预期相符，见图1。

2.2.2序列测定将阳性重组质粒经序列测定后经BLAST分析符合预期后获得所扩增的gE的核苷酸序列，结果如下。

ATGACCTCAACGGCGACCTCGACGGCGACGA CCGCCGCGCGGGCTTCGGCTCGGCCCTCGCATCCC TGAGGGAGGCGCCCCCGGCCCATCTGGTGAACGT GTCCGAGGGCGCCAACTTCACCCTCGACGCGCGCG GCGACGGCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGACGTTC CTGCCCGTCCGCGGCTGCGACGCCGTGTCGGTGAC CACGGTGTGCTTCGAGACCGCGTGCCACCCGGACC TGGTGCTGGGCCGCGCCTGCGTCCCCGAGGCCCGG GAGATGGGCATCGGCGACTACCTGCCGCCCGAGG TGCCGCGGCTCCGGCGCGAGCCGCCCATCGTCACC CCGGAGCGGTGGTCGCCGCACCTGAGCGTCCTGCG GGCCACGCCCAACGACACGGGCCTCTACACGCTG CACGACGCCTCCGGGCCGCGGGCCGTGTTCTTTGT GGCGGTGGGCGA。

将扩增的序列与GenBank数据库PRV分离株的gE基因 （GenBank号分别AF171937、KJ526427、KJ526429、KU601801和KU601804）进行核苷酸同源性比较，可见本研究测定的gE基因与GenBank数据库PRV分离株的gE基因核苷酸同源性均在99.0%以上，见图2。

3　讨　论

在过去一段时期内，PRV曾经在我国得到有效控制，但自2011年以来，我国多地均报道过免疫经典PR弱毒疫苗 （Bartha k61株）后仍然发生典型PRV感染的情况。国内多家单位对其病原学和疫苗学均进行了深入研究，发现新近流行的PRV毒株与经典PRV存在毒力差异和抗原性变异，PR疫苗（Bartha k61株）无法对猪群提供100%有效保护。但是，研究也发现，在当前尚无有效疫苗防控该型PRV之前，经典疫苗仍可提供部分保护，专家建议需继续对PR进行免疫，可有效降低因PRV感染导致的损失［6-7］。

值得欣喜的是，目前针对该病疫苗的研究已见有大量的报道，如针对新PRV进行gE单基因缺失、gE/gI双基因缺失和gE/gI/TK多基因缺失在实验室均表现较好的免疫保护［8-9］，该免疫保护可同时抵抗经典和新发PRV的感染。需要指出的是，疫苗的研发到上市还需要较长的时间，猪场在当前阶段除继续接种疫苗外，还需要在引种、日常饲养等环节加强防控，注意患病猪群的隔离和净化，也可在一定程度上减少猪场的经济损失。

［1］陈焕春，方六荣，何启盖，等.猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定［J］.畜牧兽医学报，1998，28（2）：156-161.

［2］童光志，陈焕春.伪狂犬病流行现状及我国应采取的防制措施［J］.中国兽医学报，1999，19（1）：1-2.

［3］王勤.猪伪狂犬病病毒gE基因的研究进展［J］.畜牧与兽医，2002，34（10）：42-44.

［4］Klupp B，Hengartner C，Mettenleiter T，et al.Complete，annotated sequence of the pseudorabies virus genome［J］.J Virol，2004，78（1）：424-440.

［5］李碧，朱玲，周远成，等.伪狂犬病毒神经传导研究［J］.病毒学报，2014，30（3）：332-337.

［6］彭金美，安同庆，赵鸿远，等.猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析［J］.中国预防兽医学报，2013，35 （1）：1-4.

［7］An T，Peng J，Tian Z，et al.Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs，China，2012［J］.Emerg Infect Dis，2013，19（11）：1749-1755.

［8］Gu Z，Dong J，Wang J，et al.A novel inactivated gE/gI deleted pseudorabies virus（PRV）vaccine completely protects pigs from an emerged variant PRV challenge［J］.Virus Res，2015，195：57-63.

［9］Hu R，Zhou Q，Song W，et al.Novel pseudorabies virus variant with defects in TK，gE and gI protects growing pigs against lethal challenge［J］.Vaccine，2015，33（43）：5733-5740.

The diagnosis of porcine pseudorabies virus

Wang Xia
（Huian county agricultural and forestry bureau，Quanzhou Fujian 362100）

At november of 2015，15-day-old piglets showed typical opisthotonus，depression and other neural symptoms，which shared the same as typical porcine pseudorabies virus（PRV）infection，but the piglets had been immunized with PR vaccine（Bartha-k61 strain）.Based on the epidemiological investigation and serological investigation，PCR diagnosis targeting with the gE gene of PRV，the results showed this was PRV infection.

porcine pseudorabies virus infection gE gene diagnosis

A

1003-4331（2016）04-0020-03