钙调磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路抑制剂的研究进展

吴鹏飞，刘俊麟，崔志峰（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310032）

钙调磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路抑制剂的研究进展

吴鹏飞，刘俊麟，崔志峰
（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州 310032）

钙调磷酸酶（CaN）是人体免疫调节中的关键酶，其最重要的靶标蛋白是活化T细胞核因子（NFATc）。CaN抑制剂（CNI）如环孢素A和他克莫司的免疫抑制作用的发现克服了器官移植中的免疫排斥难题，使器官移植发生了根本性的改变，迄今这两种药物仍然广泛应用于临床和基础研究，但严重的肾毒性和神经毒性也限制了它们在临床上的使用。因此，查找新的特异性更高、在临床上副作用更小的CNI是一个研究热点。本文从药物-亲和素复合物阻断底物、直接抑制CaN活性和特异性干扰CaN-NFATc相互作用三方面对最近几十年来天然的和人工合成的CNI作一综述。

钙调磷酸酶；活化T细胞核因子；免疫抑制剂；环孢素A；他克莫司

DOl：10.3867/j.issn.1000-3002.2016.04.015

钙调磷酸酶（calcineurin，CaN）是一种广泛分布于人体各种组织的Ca2+离子依赖性丝/苏氨酸（Ser/Thr）蛋白磷酸酶，又称为蛋白磷酸酶2B（pro⁃tein phosphatase 2B，PP2B）。作为Ca2+信号调节途径的关键酶，它参与了多项重要生理功能或一些病理过程的调节如T细胞活化、肌肉量调节、学习记忆的形成和老年痴呆症的发生等［1-2］。CaN是由其催化亚基A（calcineurin A，CaNA）和调节亚基CaNB组成的异二聚体。CaNA含有催化区域、CaNB结合区域B亚单位结合螺旋（B subunit bind⁃ing helix，BBH）、钙调素（calmodulin，CaM）结合区域、自身抑制区域4个功能结构域。CaNB由4个与Ca2+结合的EF手型结构（EF-hand（含E.F两段螺旋的螺旋-转角-螺旋结构域，由29个氨基酸组成的钙结合基序）构成。CaNB不具有磷酸酶活性，但对维持CaN的高度专一性和调节CaN活性是必须的。Ca2+离子和CaM结合到CaN导致其构型发生改变，露出活性中心。因此，CaN的活性是受细胞质中的Ca2+离子浓度调节的，在Ser/Thr蛋白磷酸酶家族中唯有CaN具有这种特性［3-5］。此外，CaN的活性还受内源调控蛋白，例如CaN调节蛋白（regulators of calcineurin，RCAN）的调控［6］。

CaN能催化细胞内许多蛋白脱磷酸化，其中最重要的靶标蛋白是活化T细胞核因子（nuclear fac⁃tor of activated T cells，NFATc）家族［7］。而且CaN可能是唯一的催化NFATc脱磷酸化的蛋白磷酸酶［8］。在静息T细胞中，NFATc位于细胞质中，呈高度磷酸化，一旦T细胞受到刺激，Ca2+离子迁移并激活CaN催化NFATc调节区域中的13个Ser残基脱磷酸化［9］，使其露出核定位序列并转运进入核内，调节白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-4、干扰素γ （interferon-γ，IFN-γ）和细胞表面配体白细胞分化簇抗原40配体（cluster of differentiation 40 li⁃gand，CD40L）、白细胞分化簇抗原95配体（cluster of differentiation 95 ligand，CD95L）等与免疫相关细胞因子基因的表达［10-11］。NFATc中与CaN结合的保守序列PxIxIT称为CaN结合区域1（calci⁃neurin binding region 1，CNBR1），LxVP称为CaN结合区域2（CNBR2）［12］。这两个保守序列与CaN的结合使得NFATc的调节区域非常接近CaN的活性中心，促使NFATc中特异的Ser残基被CaN脱磷酸化。NFATc中的PxIxIT保守序列也存在于其他的能与CaN结合的蛋白中［13］。因此，CaN不仅调节NFATc的活性也调节其他的转录因子，如NF-κB、转录激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）和转录因子Eph样激酶-1（Eph-like kinase 1，Elk1）的活性［14-16］。此外，CaN也会干扰其他信号途径如转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）依赖性信号途径和丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信号途径［17-18］。但是那些途径中的何种组分是CaN的底物，它们的脱磷酸化如何调节相应的信号途径仍是未知的。总之，CaN是唯一的Ca2+离子依赖性Ser/Thr蛋白磷酸酶，目前只有CaN能活化NFATc从而调节IL-2等免疫相关基因的表达，抑制CaN能完全阻断适应性免疫应答。因此，CaN被认为是调节免疫系统的关键因子［19］。

CaN抑制剂（calcineurin inhibitor，CNI）如环孢素A（ciclosporin A，CsA）和他克莫司（tacrolim⁃us，FK506）是临床上广泛使用的有效CNI，主要用于器官移植和皮肤病治疗［20-21］。但长期使用这些药物会伴有肾毒性、高血糖等多种不良反应［22-23］。因此，急需研究减少CsA和FK506的副作用，以及开发新的特异性更高、副作用更小的CNI。

1　药物-亲和素复合物阻断底物的CNl

1.1环孢素A和他克莫司

CsA是来自一种柱盘孢属真菌Cylindrocur⁃pon lucidum的由11个氨基酸组成的环状多肽，FK506是来自一种链霉菌属细菌Streptomyces tsuknbaenis的23元大环内酯类抗生素。虽然两者化学分类不同，但CsA和FK506的作用机制极其相近，都是通过与免疫亲和素亲环素A（cyclophilin A，CypA）或FK506结合蛋白12（FK506 binding protein 12，FKBP12）结合形成 CsA/CyPA或FK506/FKBP12复合物，才能成为有活性的CNI［24］。

CsA-CypA复合物和FK506-FKBP12复合物是CaN的非竞争性抑制剂，两者皆结合到CaN的BBH-CnB表面且离催化活性中心很近，由此产生空间位阻阻碍底物分子NFATc接近CaN的活性中心，掩盖NFATc中与CaN结合的保守序列LxVP，使得CaN不能对NFATc脱磷酸，进而抑制T细胞的活化。但是，小分子底物如磷酸对硝基苯酯（pnitrophenyl phosphate，pNPP）仍能被脱磷酸且活性提高了2～3倍，这可能是由于CaN与CsA-CypA 或FK506-FKBP12结合改变了其自身构象，使得CaN更易与小分子底物结合，而此种构象的改变并不能解除空间位阻对大分子底物的抑制［25-26］。其他的Ser/Thr蛋白磷酸酶如蛋白磷酸酶1（protein phosphatase 1，PP1），PP2A和PP2C不受CsACypA复合物和FK506-FKBP12复合物的影响［24］。

1.2CaN衍生物-伏环孢素（voclosporin，VCS）

VCS（ISA247）是新一代CNI，与CsA相比具有更好的免疫抑制效果，较少的不良反应［27］。VCS是 CsA上1位氨基酸的甲基被乙烯基取代的半合成抑制剂，存在同分异构体，能抑制CaN的是（E）-ISA247。VCS进入淋巴细胞后，与胞内CyPA结合形成VCS-CyPA复合物，该复合物再通过抑制CaN，抑制IL-2，IL-4，IFN-γ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-GSF）的活化。VCS具有与CyPA更高的亲和能力，可大幅减少用药量，从而降低药物的毒性。体外实验显示，VCS的免疫抑制活性是CsA的3～4倍［28］。目前VCS已在银屑病患者进行Ⅱ期和Ⅲ期临床试验［29］。

1.3他克莫司衍生物-子囊霉素（ascomycin，FK520）和匹美克莫司（pimecrolimus）

子囊霉素和匹美克莫司都是FK506衍生物，作用方式与FK506相同。子囊霉素是从吸水链霉菌（Str.hygroscopicus）产物中分离得到的FK506天然衍生物，在结构上与FK506的区别仅在于21位上烯丙基转变为乙基。子囊霉素-FKBP复合物可有效抑制CaN的活性（Ki=89 nmol·L-1）、NFATc的转录活性（IC50=0.8 nmol·L-1）以及体外T细胞的增殖（IC50=0.7 nmol·L-1）［30-31］。近来有研究表明，子囊霉素-FKBP复合物不仅能抑制淋巴细胞非特异性多克隆活化增殖，而且能显著抑制抗原特异性T细胞的增殖［32］。匹美克莫司是一个半合成的子囊霉素的衍生物（33-表氯-33-脱氧-子囊霉素，33-epichloro-33-desoxy-ascomycin）。与FK506相比，匹美克莫司-FKBP复合物抑制CaN的能力只有FK506-FKBP复合物的约1/3，但匹美克莫司具有更好的亲脂性，对皮肤有更好的亲和力，用药后引起全身性免疫应答轻微。临床上匹美克莫司被用于治疗中度特异性皮炎［33］。

CsA、FK506及其衍生物的作用模式和抑制效应（见表1）。目前，CsA、FK506和它们的衍生物是临床上广泛使用的最有效的免疫抑制剂，但这类药物都必须与其免疫亲和素结合形成复合物才能起作用。免疫亲和素属于肽酰脯氨酰顺反异构酶类（peptidylprolyl cis/trans isomerase，PPIase），参与调节蛋白质的从头折叠以及多项重要的细胞功能［34］。临床上长期使用CsA和FK506会有较严重的副作用如肾毒性等可能与这类药物都必须与其免疫亲和素结合形成复合物才能起作用有关。但是，这些副作用主要是来自抑制CaN还是来自免疫亲和素相关的机制仍属未知。而且，这些副作用是由于CaN-NFATc途径的调控引起的还是由于其他的途径或转录因子的调控引起的也不清楚。因此，能特异性地抑制CaN但不抑制PPIase，能特异性地抑制NFATc但不抑制其他转录因子的药物，应比CsA 和FK506及其衍生物特异性更高，在临床上副作用更小。

表1　环孢素A（CsA）、他克莫司（FK506）及其衍生物的作用模式和抑制效应

2　直接作用于钙调磷酸酶的抑制剂

2.1槲皮素（quercetin）

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，不需与任何免疫亲和素结合便可直接作用于CaN的催化亚基，非竞争性可逆抑制CaN。以RⅡ多肽和pNPP为底物的体外CaN活性测定实验中，槲皮素的IC50分别为11.2±2.0和（281.8±4.0）μmol·L-1。在Jurkat细胞中，槲皮素亦显著抑制IL-2的表达。在免疫细胞应答实验中，槲皮素还可有效抑制刀豆蛋白A （ConcanavalinA，ConA）诱导的T细胞和脂多糖诱导的B细胞增殖［38］。有研究表明槲皮素与FK506-FKBP和CsA-CyPA复合物具有相似的作用位点［39］。此外，槲皮素作为许多治疗肝肾损伤的中药材的活性成分，可明显改善CsA所致的肾毒性［40］。

2.2山奈酚（kaempferol）

山奈酚是一个天然黄酮醇化合物，在以pNPP和RⅡ肽为底物的实验中能抑制纯化的CaN活性［41］。山奈酚可直接作用于CaN的催化亚基并抑制其活性，不需要任何媒介蛋白。其他蛋白磷酸酶如PP1和碱性磷酸酶的活性不受山奈酚影响。山奈酚能抑制Jurkat T细胞中IL-2基因的表达［41］。奇怪的是，山奈酚在HEK293细胞中也抑制不依赖CaN的肿瘤坏死因子α（tumor necrosis facror-α，TNF-α）诱导的NF-κB的活化［42］。

2.3CN585

CN585是一种人工合成的有机小分子［6-（3，4-二氯苯基）-4-（N，N-二甲基氨基乙巯基）-2-苯基嘧啶］，作用位点位于CaN的催化亚基，无论在体外还是在胞内均可非竞争性可逆直接抑制CaN而不需与免疫亲和素结合。以RⅡ多肽为底物的CaN活性测定实验中，CN585可有效抑制CaN活性（IC50=3.5 μmol·L-1）。在外周血单核细胞（periph⁃eral blood mononuclear cell，PBMC）和Jurkat细胞中，CN585能明显抑制细胞因子IL-2的产生〔（IC50=（13±2）μmol·L-1〕，NFAT核转入和转录激活作用〔（IC50=（10±3）μmol·L-1〕和T细胞的增殖〔IC50=（9.4±1.1）μmol·L-1〕［43］。此外，CN585在有效药物浓度内，不会产生细胞毒性，亦不会抑制其他蛋白磷酸酶（PP1，PP2A和PP2C）或CyP18、FKBP12和PPIase1（Pin1）的活性［43］。

2.4CaN424-521-AlD

CaN424-521-AID是一段来自CaN的催化亚基自身抑制区的肽类抑制剂，为424～521位氨基酸残基组成的多肽。CaN424-521-AID与CaN结合后，通过阻止底物蛋白接近CaN的活性中心，从而抑制CaN对底物蛋白的作用。以RⅡ多肽为底物的CaN活性测定实验显示，CaN424-521-AID可抑制RⅡ多肽脱磷酸化（IC50=2.5 μmol·L-1）［44］。其中457-482位残基是CaN424-521-AID起作用的核心区域，经多聚精氨酸修饰后的11R-CaN457-482-AID更易被细胞吸收，可抑制兴奋性神经元细胞的凋亡和CaN诱导的胰岛腺泡细胞活化［45］。

直接抑制CaN活性的抑制剂的作用模式和抑制效应见表2。这类抑制剂直接抑制CaN而不需要辅助蛋白，可能具有低毒性。但由于CaN在人体的多项重要生理过程中起着调节作用，直接抑制CaN活性的抑制剂除了通过抑制CaN对NFATc的脱磷酸化从而抑制免疫活性外，亦可能会抑制CaN对其他底物的脱磷酸化。因此，特异性地抑制CaN对NFATc的脱磷酸化而不影响CaN对其他底物的脱磷酸化的抑制剂，在临床上副作用应会更小。

3　特异性干扰CaN-NFATc相互作用的抑制剂

3.1PxlxlT肽类

PxIxIT肽类是一段来自NFATc中与CaN-结合的保守序列PxIxIT的衍生物。含有PxIxIT片段的肽类能与NFATc竞争在CaN上的结合位点，从而阻止CaN对NFATc1、NFATc2、NFATc4脱磷酸化［55］。且在PxIxIT肽类过表达的细胞中，CaN对其他底物的脱磷酸化活性都不受影响［55］。从PxIxIT序列组合文库中筛选得到的16肽的VIVIT多肽较最初的PxIxIT多肽（16肽的SPRIEIT寡肽）的活性高25倍，能更有效地同NFATc竞争在CaN上的结合位点，阻断依赖NFATc的转录。GFP-VIVIT融合蛋白在Jurkat T细胞的过表达显著抑制NFATc-依赖性报告基因的表达，但不抑制NF-κB-依赖性报告基因的表达。因此，VIVIT寡肽能比CsA和FK506复合物选择性更高地抑制它们的转录因子［56］。其更易被细胞吸收的衍生物11R-VIVIT多肽能显著延长经胰岛细胞移植后小鼠的生存期，同时不影响移植后的胰岛细胞生成胰岛素［57］。最近一项研究表明，另一PxIxIT多肽衍生序列ZIZIT多肽亦可显著抑制CaN对NFATc脱磷酸化，其对CaN的亲和力较VI⁃VIT多肽提升了10倍［58］。

3.2NCl3

NCI3是一种吡唑并嘧啶衍生物，可干扰CaNNFATc信号通路。体外实验，显示NCI3不抑制CaN活性。但在初级人类T细胞中，NCI3抑制NFATc脱磷酸化和核转入，以及IL-2基因的表达和细胞增殖。体外实验显示NCI3能部分干扰CaN与VIVIT寡肽结合，由此推测可能是NCI3结合于CaN后引起CaN构型变化，从而干扰NFATc脱磷酸化［59］。NCI3对催化NFATc磷酸化的激酶，cAMP依赖性蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β），无明显影响。此外，NCI3对NF-κB途径也有部分抑制作用。在Jurkat细胞中进行的报告基因研究显示，NCI3抑制NFATc-荧光素酶报告基因的IC50为2 μmol·L-1，而抑制NF-κB-荧光素酶报告基因的IC50为7 μmol·L-1。NCI3的这些效应均能被CaN过表达消除［59］。

表2　直接抑制钙调磷酸酶（CaN）活性的抑制剂

3.3lNCA-6

NFATc-CaN相互作用抑制剂6（inhibitors of NFATc-calcineurin association 6，INCA-6）是在筛选NFATc-CaN相互作用的抑制剂中获得的一种三苯烯类有机小分子化合物，分子式为9，10-二氢-9，10［1′，2′］-二三苯烯基-1，4-二酮。INCA-6能可逆共价地与CaN的残基Cys266结合，导致其空间结构改变，掩盖了其序列上的NFATc和VIVIT肽的结合位点，选择性地干扰CaN与NFATc的相互作用，但不影响其他底物的脱磷酸化。在离子霉素（iono⁃mycin）-刺激的Cl.7W2小鼠T细胞实验中，INCA-6抑制NFATc脱磷酸化，核转入，以及IFN-γ和TNFα的表达［60］。但是，所有的INCA化合物都已被报道有普通的细胞毒性，排除了它们在初级细胞中应用的可能性［61］。

CaN-NFAT相互作用抑制剂的作用模式和抑制效应见表3。这类新型的抑制剂特异性抑制CaN 与NFATc的相互作用，而不影响CaN对其他靶标蛋白的脱磷酸化活性，具有更高的选择性和专一性。因此，这类新型的抑制剂将会有较小的毒副作用。

表3　特异性干扰钙调磷酸酶-活化T细胞核因子（CaN-NFAT）相互作用抑制剂

4　展望

CaN是人体免疫调节中的关键酶，其最重要的靶标蛋白是NFATc。近年来，在开发CsA和FK506衍生物方面已取得了可喜的进展，如CsA衍生物VCS具有与CyPA更高的亲和能力，可大幅减少用药量，从而降低药物的毒性。目前VCS不仅已用于牛皮癣患者临床治疗，而且在眼色素层炎患者治疗中也已开始使用［63］。匹美克莫司是FK506衍生物，与FK506相比具有更好的亲脂性，对皮肤有更好的亲和力，用药后引起全身性免疫应答轻微，但长期使用这类药物仍会有较严重的副作用如肾毒性和神经毒性［64］。如何减少CsA和FK506及其衍生物的副作用是临床上一个重要的研究课题。

引起CsA和FK506类药物副作用的原因目前仍不清楚，目前在基础研究中已发现一些CaN直接抑制剂如槲皮素和山奈酚，它们直接抑制CaN而不需要辅助蛋白，具有低毒性［38，41］。槲皮素不仅可直接抑制CaN活性，还对人体肝、肾具有保护作用［40］。而在基础研究中已发现的特异性干扰CaN-NFATc相互作用抑制剂如11R-VIVIT多肽和NCI3能特异性抑制NFATc而不影响CaN对其他靶标蛋白的脱磷酸化活性，具有更好的选择性［57，59］。开发新的选择性更高、副作用更小的CaN-NFATc抑制剂将是今后免疫抑制剂发展的重要方向之一。

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（本文编辑：贺云霞）

Signaling pathway inhibitors of calcineurin-nuclear factor of activated T cells：research progress

WU Peng-fei，LIU Jun-lin，CUI Zhi-feng
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032，China）

Calcineurin（CaN）serves as a key enzyme in human immune regulation.The most important target of this enzyme is the transcription factors of nuclear factors of activated T cells （NFATc）.The discovery of the immunosuppressive function of CaN inhibitors（CNIs），ciclosporin A （CsA）and tacrolimus（FK506），has helped overcome the immune rejection of organ transplantion and changed organ transplantion fundamentally.Both of these drugs are still widely used in clinical and basic research，but their therapeutic effects are limited by their serious side effects，including renal tox⁃icity and neurotoxicity.Therefore，the development of new CNIs with higher specificity and fewer side effects in the clinic is a focus of research.In this paper，the newly discovered and synthesized CNIs in recent decades，including the CsA and FK506 derivatives，direct inhibitors of CaN，as well as the inhibitors that specifically interfere with CaN-NFATc interaction，were summarized.

calcineurin；nuclear factor of activated T cells；immunosuppressants；ciclosporin A；tacrolimus

Fourdation item：The project supported by Scientific Research Foundation of Zhejiang Province（LY12C14008）

Tel：（0571）88320741，E-mail：zfcui@zjut.edu.cn

R966

A

1000-3002-（2016）04-0397-08

浙江省自然科学基金（LY12C14008）

吴鹏飞，男，硕士研究生，主要从事酶抑制剂的筛选和研究。

崔志峰，E-mail：zfcui@zjut.edu.cn，Tel：0571-88320741

2015-03-02接受日期：2015-05-27）