醛固酮诱导人肾小管上皮细胞胶原Ⅰ、Ⅲ表达的研究*

黄海燕，魏佳莉

(海南省人民医院：1.中心实验室；2.肾内科，海口 570100)



醛固酮诱导人肾小管上皮细胞胶原Ⅰ、Ⅲ表达的研究*

黄海燕1，魏佳莉2△

(海南省人民医院：1.中心实验室；2.肾内科，海口 570100)

目的探讨Rho激酶对醛固酮(ALD)诱导的人肾小管上皮细胞胶原Ⅰ、Ⅲ(COL Ⅰ、Ⅲ)表达的影响。方法将人肾小管上皮细胞HK-2培养于含15%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养液中,ALD受体拮抗剂依普利酮(10 μmol/L)和Rho激酶抑制剂Y27632(1 μmol/L)预处理细胞30 min后，100 nmol/L ALD作用HK-2细胞24 h，实时定量PCR法检测各组细胞中COLⅠ、Ⅲ mRNA的表达，酶联免疫吸附试验测定培养上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶蛋白表达水平。结果ALD可上调HK-2细胞中COL Ⅰ、Ⅲ mRNA的表达，并增加培养上清液中Rho激酶、COL Ⅰ、Ⅲ蛋白表达水平，Rho激酶抑制剂Y27632及ALD受体拮抗剂依普利酮可拮抗上述效应。结论ALD可活化HK-2细胞Rho激酶信号传导通路，并通过Rho激酶诱导HK-2细胞COL Ⅰ、Ⅲ的表达而加速肾小管间质纤维化的进展。

醛固酮；胶原Ⅰ；胶原Ⅲ；Rho激酶；人近端肾小管上皮细胞；肾小管间质纤维化

肾小管间质纤维化是衡量慢性肾脏疾病进展的重要指标之一，是各种肾脏疾病慢性进展，最终致慢性肾衰竭的共同机制[1]。肾间质纤维化的本质是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度合成而致ECM的异常沉积[2]。近期研究表明，醛固酮(aldosterone，ALD)在肾间质纤维化的发病机制中起着重要作用，可促进体外培养的肾小管上皮细胞表达致纤维化的细胞因子及ECM的表达，是胶原合成的强烈刺激剂[3]。但具体机制仍未完全明确。Rho三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，GTP)酶家族是Ras超家族中的一员，是真核细胞内重要的信号传递分子，在真核细胞信号传导过程中发挥着分子开关作用。目前发现该家族包括RhoA、RhoB、RhoC等在内的15种成员，其中Rho激酶是RhoA的下游效应蛋白，相对分子质量约160×103，是一个丝/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，在细胞增殖、凋亡及细胞转型等过程中起关键调节作用[4-7]。本实验旨在观察ALD对人肾小管上皮细胞Rho激酶活性的影响，探讨Rho激酶信号转导通路与ALD诱导的肾小管上皮细胞胶原Ⅰ(collagen Ⅰ，COL Ⅰ)、胶原Ⅰ(collagen Ⅲ，COL Ⅲ)表达的关系。

1　材料与方法

1.1材料人近端肾小管上皮HK-2细胞购自中南大学湘雅医学院细胞库，来源于美国标准培养物保藏中心(ATCC)。ALD(eplerenone,EPL,美国Amersco公司)，依普利酮(eplerenone,EPL,美国Sigma公司)，Rho激酶抑制剂Y27632(以下简称Y27632，美国Sigma公司)，Trizol试剂、RNA反转录试剂盒、实时定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，COL Ⅰ、COL Ⅲ、Rho激酶酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(上海劲马公司)，胎牛血清(FBS)、RPMI-1640培养基(美国Gibco公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养及药物干预HK-2细胞培养于含15%FBS的RPMI-1640培养液中，实验前用无血清培养液同步化24 h。EPL(10 μmol/L)和Y27632(1 μmol/L)预处理细胞30 min后，100 nmol/L ALD作用于HK-2细胞24 h，作为ALD-EPL组与ALD-Y27632组。另外以未处理HK-2细胞作为对照组，100 mmol/L ALD刺激HK-2细胞作为ALD组。

1.2.2实时定量PCR法检测细胞中COL Ⅰ、Ⅲ mRNA的表达Trizol提取细胞总RNA。取2 μg RNA反转录为cDNA。应用Primer Premier 5.0软件设计引物，COL Ⅰ(142 bp): 正义5′-GTG GTG AGA CTG GTC CTG CTG-3′，反义5′-AAG CCA CGG TGA CCC TTT ATG-3′；COLⅢ(193 bp)：正义5′-GCC TCC CAG AAC ATT ACA TAC C-3′，反义5′-CTG TCT TGC TCC ATT CAC CAG-3′；3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH，145 bp)：正义5′-GGG TGT GAA CCA TGA GAA GTA TG-3′，反义5′-GAT GGC ATG GAC TGT GGT CAT-3′。引物由上海invitrogen公司合成。PCR 反应条件：94 ℃变性5 min；然后94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35个循环；再于72 ℃延伸5 min。计算目的基因与内参GAPDH的比值，即得目的基因mRNA的表达量。

1.2.3ELISA法检测细胞培养上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶的表达收集细胞上清液，ELISA法检测细胞上清液中COL Ⅰ、Ⅲ及Rho激酶的表达，按试剂盒说明书操作。

2　结　　果

2.1ALD对HK-2细胞Rho激酶蛋白表达的影响对照组HK-2细胞培养上清液中表达一定含量的Rho激酶蛋白[(51.29±2.74)pg/mL]，100 nmol/L的ALD刺激细胞24 h后(ALD组)，培养上清液中Rho激酶蛋白表达[(74.71±2.61)pg/mL]较对照组明显增加，差异有统计学意义(P<0.001)。与ALD组比较，ALE-EPL组[(39.51±1.99)pg/mL]和ALD-Y27632组[(48.79±0.45)pg/mL]Rho激酶蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(P<0.001)，表明EPL和Y27632均可逆转ALD的上述效应。见图1。

*：P<0.01，与对照组比较；#：P<0.01，与ALD组比较。

图1ALD对HK-2细胞Rho激酶蛋白表达的影响

2.2ALD对HK-2细胞COL Ⅰ、Ⅲ mRNA表达的影响实时定量PCR结果显示，对照组HK-2细胞中有少量COL Ⅰ、Ⅲ mRNA表达，100 nmol/L的ALD作用HK-2细胞24 h后(ALD组)，与对照组相比，COL Ⅰ、Ⅲ mRNA表达水平均明显增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。与ALD组相比，ALD-EPL组COLⅠ、Ⅲ mRNA表达水平均降低，差异有统计学意义(P<0.01，P<0.001)；ALD-Y27632组COLⅠ、Ⅲ mRNA表达水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.01，P=0.001)，表明EPL和Y27632均可明显抑制ALD所诱导的COLⅠ、Ⅲ mRNA表达。见图2。

2.3ALD对HK-2细胞培养上清液COLⅠ、Ⅲ 蛋白含量的影响对照组HK-2细胞培养上清液中有一定含量的COLⅠ、Ⅲ 蛋白表达[(5.02±0.77)、(3.95±0.20)μg/mL]，100 nmol/L的ALD刺激细胞24 h后(ALD组)，培养上清液中COLⅠ[(8.63±0.83)μg/mL，P<0.01]、COLⅢ蛋白[(6.0±0.32)μg/mL,P=0.001]表达水平较对照组均明显增加。与ALD组相比，ALD-EPL组COLⅠA1[(3.70±0.46)μg/mL]、COLⅢA1[(3.66±0.20)μg/mL]表达水平均降低，差异均有统计学意义(P<0.01，P<0.001)；ALD-Y27632组COLⅠA1[(2.19±0.46)μg/mL]、COLⅢA1[(1.36±0.18)μg/mL]表达水平均降低,差异均有统计学意义(均P<0.001)，表明EPL和Y27632均可明显抑制ALD所诱导的COLⅠ、Ⅲ 蛋白的表达。见图3。

*：P<0.05，与对照组比较；#：P<0.01，△：P<0.001，▲：P=0.001，与ALD组比较。

图2ALD对HK-2细胞COLⅠ、Ⅲ mRNA表达的影响

*：P<0.01，△：P=0.001，与对照组比较；#：P=0.001，▲：P<0.001，与ALD组比较。

图3ALD对HK-2细胞培养上清液COLⅠ、Ⅲ蛋白含量的影响

3　讨　　论

肾小管间质纤维化是衡量慢性肾脏疾病进展的重要指标之一，是各种肾脏疾病慢性进展，最终致慢性肾衰竭的共同机制[8]。近年来大量临床和实验研究表明，在各种肾脏疾病中，肾小管间质的病变程度是反映肾功能减退严重程度和判断预后最重要的指标。因此,对其发生、发展的机制，以及其防治的研究越来越受到国内外研究学者的重视。目前,尽管采用了多种干预治疗措施，仍无法有效延缓大多数患者肾小管间质纤维化的进展，并且随着血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)和(或)血管紧张素受体阻滞剂(ARB)在各种肾病患者中的广泛应用及深入研究，越来越多的临床证据表明，随治疗时间的延长,ALD脱逸现象的发生导致其降压外的器官保护效应亦逐渐消失。因此，找寻肾小管间质纤维化可能的发病机制及干预措施，具有十分重要的卫生、经济和社会意义。

ALD是调节人体水盐代谢的重要激素，除肾上腺皮质外，肺动脉和肠系膜上动脉的血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、肝脏、肾脏及脑组织中均发现ALD合成酶，其可催化合成单乙酰基ALD，并通过旁分泌或自分泌的方式在局部发挥作用。过去一直认为，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素-血管紧张素-ALD系统中造成肾损伤的主要物质。近年的研究结果发现，在进展性肾脏疾病中，ALD亦是重要的独立的致病因子，其可通过血流动力学效应和直接作用促进肾脏疾病的发生、发展，具有完全不依赖AngⅡ的独立的致器官纤维化作用，是有丝分裂和胶原合成的强烈刺激剂[3]。

动物实验及临床资料均表明，肾脏疾病的进展与ALD有密切关系。各种肾衰竭动物模型及临床慢性肾衰竭患者均存在高ALD血症，在大鼠肾衰竭模型中，ALD水平与高血压、蛋白尿和组织损伤的严重程度明显相关[9]。Walker等[10]亦报道了糖尿病肾病患者血浆ALD水平与肾损伤程度明显相关。随着ACEI及ARB在肾病患者中的广泛应用及深入研究，越来越多的临床证据发现，随治疗时间的延长，ALD脱逸现象的发生导致其降压外的器官保护效应亦逐渐消失。而该效应在加用ALD受体拮抗剂后又再次出现[11]。以上均提示ALD在残余肾的进一步损伤中起着重要的作用。ALD引起肾损伤的机制涉及多个方面。在大鼠抗thy1.1系膜增生性肾小球肾炎模型、单侧肾切除致高血压的大鼠模型、残余肾衰竭模型、慢性环胞霉素A肾毒性、糖尿病肾病的大鼠模型中发现，ALD能增加前炎性因子的表达，上调转化生长因子-β1(TGF-β1)、刺激肾间质COLⅠ合成和纤维连接蛋白分泌，而ALD受体拮抗剂，则可减低上述炎性因子及TGF-β1的表达，延缓肾间质纤维化的形成，但具体机制尚不明确。与以往的报道相一致，本试验结果提示ALD可明显上调HK-2细胞COLⅠ、Ⅲ mRNA和蛋白的表达，证实ALD可直接诱导肾小管上皮细胞COLⅠ、Ⅲ的合成与分泌，同时盐皮质激素受体(MR)拮抗剂EPL可拮抗上述效应。

本研究证实，ALD可激活HK-2细胞Rho激酶信号传导通路。Nagatoya等[12]用Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled coil forming protein kinase，Rock)的特异性抑制剂Y-27632干预小鼠单侧输尿管结扎肾间质纤维化模型，发现其早期炎性细胞浸润明显减少，小管间质纤维化也明显减轻，提示Rho激酶可能通过介导早期炎性细胞浸润和炎性介质分泌参与肾间质纤维化的发生。Sun等[13]报道，Rho激酶通过TGF-β1依赖旁路参与ALD诱导的肾小管间质损伤。但迄今为止，Rho激酶信号转导通路是否参与ALD诱导的肾小管上皮细胞胶原的合成国内外尚未见报道。本研究证实，ALD可激活HK-2细胞Rho激酶的活化，同时Rho激酶抑制剂可抑制ALD诱导的肾小管上皮细胞COLⅠ、Ⅲ的分泌。

综上所述，本试验证实ALD可激活HK-2细胞Rho激酶信号传导通路，并通过Rho激酶诱导HK-2细胞COLⅠ、Ⅲ的分泌，从而加速肾小管间质纤维化的进展。

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Study on expressions of collagen Ⅰ and Ⅱ in aldosterone-induced human kidney tubular epithelial cells*

HuangHaiyang1，WeiJiali2△

(1.CentralLaboratory；2.DepartmentofNephrology,HainanProvincialGeneralHospital,Haikou,Hainan570100,China)

ObjectiveTo investigate the role of Rho kinase on collagen(COL)Ⅰ and Ⅲ expression of human renal tubular epithelial cells.MethodsHuman kidney tubular epithelial (HK-2) cells were cultured in the RPMI-1640 culture solution containing 15% fetal bovine serum.After 30 min pretreatment by the ALD receptor antagonist eplerenone(10 μmol/L) and Rho kinase inhibitor Y27632(1 μmol/L),100 nmol/L ALD acted the HK-2 cells for 24 h.The expressions of collagenⅠ and Ⅲ mRNA in each group were detected by real time PCR and the expression levels of COL Ⅰ,Ⅲ and Rho kinase protein were detected by ELISA.ResultsALD could up-regulate the expressions of COLⅠ,Ⅲ mRNA in HK-2 cells,and increased the levels of Rho kinase,COLⅠ and Ⅲ protein,while the Rho kinase inhibitor Y27632 and ALD receptor inhibitor eplerenone could antagonize these effects.ConclusionALD could activate Rho kinase signal transduction pathway in HK-2 cells and accelerate the progression of tubular interstitial fibrosis via Rho kinase induced expression of COL Ⅰ and Ⅲ.

aldosterone；collagen-Ⅰ;collagen-Ⅲ；Rho kinase；human proximal tubular epithelial cells；tubular interstitial fibrosis

海南省社会发展科技专项项目(2012SF04、2013SF04和2015SF43)。作者简介：黄海燕(1980-)，主管技师，本科，主要从事细胞遗传学研究。△

，E-mail:wjl525@163.com。

R692

A

1671-8348(2016)21-2900-03

2016-01-24

2016-04-11)

论著·基础研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.21.006