SNP位点rs6983267相关非编码RNA G/U对结肠癌细胞转移活性的影响

蔡文臣，郝小惠，沈阳丽，孟晨雪，田洁，郭志义

(华北理工大学医学实验研究中心，河北唐山063000)



SNP位点rs6983267相关非编码RNA G/U对结肠癌细胞转移活性的影响

蔡文臣，郝小惠，沈阳丽，孟晨雪，田洁，郭志义

(华北理工大学医学实验研究中心，河北唐山063000)

目的 探讨染色体8q24区域中单核苷酸多态性(SNP)位点 rs6983267相关非编码RNA G/U对结肠癌细胞转移活性的影响。方法 运用生物信息学方法分析SNP rs6983267位点的非编码RNA；收集KM12C和KM12SM细胞，提取细胞总RNA，逆转录和PCR扩增，片段回收后用Tsp45Ⅰ进行酶切，对酶切(酶切组)和不做酶切(对照组)的模板做PCR扩增分析。通过限制性内切酶-PCR方法检测两组SNP rs6983267位点的非编码RNA G/U相对表达量；KM12C和KM12SM细胞分别进行pGL3-Gs-LUC(pGL3-Gs-LUC组)、pGL3-Ts-LUC(pGL3-Ts-LUC组)和pGL3-Basic-LUC质粒转染，应用双荧光素酶报告基因方法检测两组KM12C和KM12SM细胞中rs6983267非编码RNA启动子活性。结果 ENCODE数据库显示，染色体8q24区域SNP rs6983267位点附近存在非编码基因。KM12C细胞中酶切组、对照组SNP rs6983267位点相关非编码RNA G/U为0.80±0.10、5.60±1.30，KM12SM细胞中分别为0.71±0.09、1.43±0.11。与对照组比较，KM12C细胞中酶切组SNP rs6983267位点相关非编码RNA G/U差异无统计学意义(P﹥0.05),KM12SM细胞中升高(P<0.05)。KM12C细胞中，pGL3-Gs-LUC组、pGL3-Ts-LUC组rs6983267位点相关G型与T型非编码RNA启动子相对活性分别为0.81±0.14、0.82±0.25，KM12SM细胞中分别为1.00±0.26、1.85±0.58。在KM12SM细胞中，两组比较，P<0.05；在KM12C细胞中，两组比较，P﹥0.05。结论 SNP rs6983267位点相关非编码RNA G/U可能与结肠癌细胞的转移活性相关。

结肠肿瘤；肿瘤转移；单核苷酸多态性；rs6983267；非编码基因

结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤，其发病率和病死率在所有恶性肿瘤中占第3位[1]。近年，我国结直肠癌发病率也在不断升高，目前已高达31/10万。全基因组关联分析研究表明，位于8q24染色体上的SNP 位点rs6983267与结肠癌的发生高度相关[2]。染色体8q24区为基因沙漠区，大范围缺少蛋白质编码基因。有研究报道，SNP rs6983267可以作为增强子[3～5]，也可以作为非编码基因发挥作用，如CCAT2。长链非编码RNA (LncRNA)一般指转录长度大于200 nt的非编码RNA[6,7]。大量研究表明，LncRNA参与了许多真核细胞内生物活动,其异常表达还与许多人类疾病如肿瘤的发生、发展密切相关。2013年5月～2015年12月，我们探讨了8q24 染色体上的SNP位点rs6983267的LncRNA基因表达与结肠癌转移的关系。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌细胞系KM12C和KM12SM由本实验室保存；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司；T载体试剂盒由天根生化科技有限公司提供；引物由北京博迈德生物技术有限公司合成；细胞转染试剂为Invitrogen的Lipofectamine®2000；设计的非编码基因序列的检测以及启动子扩增引物，上游引物：5′ATACCCTCATCGTCCTTTGAGC3′,下游引物：5′GGGTTCCTGCCCTTTGATT3′。

1.2 转染质粒构建 用上述引物进行PCR扩增长度为153 bp的非编码基因启动子片段、T载体克隆，通过sacⅠ和NcoⅠ双酶切后与pGL3-Basic连接，然后酶切鉴定阳性克隆，测序确认。分别命名为pGL3-Ts-LUC及pGL3-Gs-LUC。

1.3 细胞培养和转染 KM12C和KM12SM两种细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，37 ℃含 5%的CO2培养箱内进行常规传代培养。细胞转染依照说明书进行，待细胞长满进行转染前铺板，转染前1 h将完全培养基换成无血清培养基，然后将质粒pGL3-Ts-LUC、pGL3-Gs-LUC和转染试剂Lipofectamine®2000分别进行稀释，将稀释后的两种溶液混合，15 min后将混合液转入细胞中，24 h后换成完全培养基。

1.4 染色体8q24区的非编码基因分析 采用生物信息方法通过ENCODE数据库(http://genome.ucsc.edu/ENCODE/)比对(BLAT)分析。

1.5 KM12细胞系中SNP rs6983267位点相关非编码RNA G/U相对表达的检测 采用限制性内切酶-PCR法。利用rs6983267位点具有Tsp45Ⅰ识别位点来区分G/T差别(即为T时，具有Tsp45Ⅰ位点，为G时候，位点消失)：首先收集KM12C和KM12SM细胞，通过TRIzol法提取细胞总RNA，然后通过RQ-DNAse消化去除基因组DNA污染，随机引物法进行逆转录和PCR扩增，片段回收，之后用Tsp45Ⅰ进行酶切，用上述引物对酶切(酶切组)和不做酶切(对照组)的模板做PCR扩增分析。

1.6 KM12细胞系中rs6983267非编码RNA启动子活性的检测 采用双荧光素酶报告基因法。对KM12C和KM12SM细胞分别进行pGL3-Gs-LUC(pGL3-Gs-LUC组)、pGL3-Ts-LUC(pGL3-Ts-LUC组)和pGL3-Basic-LUC质粒转染，24 h后除去培养细胞中的培养基，用 1×PBS 清洗培养细胞后裂解细胞，室温15 min后，收集细胞裂解液，将其转入96孔检测板中，置于微孔板仪检测，读取数据。

2 结果

2.1 染色体8q24区的非编码基因 通过ENCODE数据库比对分析，发现染色体8q24rs6983267位点上存在多个非编码RNA表达(GM78细胞)。

2.2 不同细胞中两组SNPrs6983267位点相关非编码RNAG/U相对表达比较KM12SM细胞中酶切组、对照组SNPrs6983267位点相关非编码RNAG/U分别为0.71±0.09、1.43±0.11，KM12C细胞中分别为0.80±0.1、5.60±1.30。与对照组比较，KM12C细胞中SNPrs6983267位点相关非编码RNAG/U差异无统计学意义(P>0.05)，KM12SM细胞中升高(P<0.05)。

2.3KM12细胞系中rs6983267非编码RNA启动子活性KM12C细胞中，pGL3-Gs-LUC组、pGL3-Ts-LUC组rs6983267位点相关G型与T型非编码RNA启动子相对活性分别为0.81±0.14、0.82±0.25，KM12SM细胞中分别为1.00±0.26、1.85±0.58。在KM12SM细胞中，两组比较，P<0.05；在KM12C细胞中，两组比较，P﹥0.05。

3 讨论

现代分子生物学研究表明，人类基因组的大部分并不编码蛋白质，这些被称为非编码基因。以往的观点认为，这些序列无用并称为垃圾DNA。越来越多的研究表明，非编码基因在生物发育以及疾病发生过程中起着重要作用[7,8]。本研究发现，在基因沙漠区的染色体8q24区域中SNPrs6983267位点附近存在非编码基因，其等位基因转录的非编码RNAG/U比率与结肠癌细胞的转移活性相关。

研究报道，SNPrs6983267不同的基因型与肿瘤发生相关。如在甲状腺癌的研究中，G被认为是隐性危险因子(即GG基因型与疾病相关，GT或TT不相关)[9]；在我国胃癌人群的研究中发现GT杂合型是危险因子[10]。可见，不同基因型可能在肿瘤发生过程中起着不同作用。在结肠癌的研究中，通常认为G为危险因子，但是在糖尿病结合结肠癌病例对照研究以及无蒂锯齿状结肠癌的研究中，发现结肠癌的发生与基因型TT相关[11]。染色体8q24为基因沙漠区，缺少蛋白质编码基因。有研究报道，此区域有一非编码基因CCAT2的表达[12]，上游也有miRNA的报道[12,13]。本研究的结果以及ENCODE数据库(GM78细胞)也显示此区域有非编码RNA的表达。在本研究中，高转移活性的KM12SM细胞的SNPrs6983267G/U比率高于低转移活性的KM12C细胞，可能在肿瘤细胞转移活性的获得过程中，存在某种基因调控网络的改变。研究发现，Notch信号传导途径效应因子RBPJ缺失会促进结肠癌转移[14]；Rho因子可能与Trio磷酸化相关，并可作为术后预后的重要指标[15]。近年，无蒂锯齿状结肠癌的研究得到关注，其恶性程度更高、预后差，与普通结肠癌不同，rs6983267位点的TT基因型与肿瘤相关[11]。KM12系列细胞是常用的肿瘤细胞转移活性研究模型，建立时间早，当时并没有无蒂锯齿状结肠癌的分类，因此无法得知KM12系列细胞是否来自无蒂锯齿状结肠癌患者。

报告基因分析显示，rs6983267位点存在转录活性，并具有RNA聚合酶Ⅲ的特点，这也与ENCODE数据库一致。结果显示，T型启动子的活性高于G型启动子活性，说明RNA的G/U差别来自转录水平的变化。转录调控是基因表达调控研究的枢纽,向上游可以分析信号转导系统，向下游可以分析基因的表达模式[16]。因此，有可能相关信号转导途径的改变影响了启动子转录因子的结合及rs6983267的转录活性，从而造成其差异表达。

总之，本研究结果显示，rs6983267位点的非编码RNAG/U的表达比率可能与结肠癌细胞的转移活性相关。这也将有助于解释全基因组关联分析的结果，同时也为其临床应用以及肿瘤的基础研究提供可借鉴的实验依据。

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Effect of SNP rs6983267-related non-coding RNA G/U on the metastatic activity of colon carcinoma cells

CAIWenchen,HAOXiaohui,SHENYangli,MENGChenxue,TIANJie,GUOZhiyi

(MedicalResearchCenterofNorthChinaofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the effect of SNP rs6983267 in the 8q24 region on chromosome-related non-coding RNA G/U on the metastatic activity of colon carcinoma cells.Methods We analyzed the non-coding RNA of SNP rs6983267 by bioinformatics. The KM12C and KM12SM cells were collected, and the total RNA was extracted from the cells. Reverse transcription and PCR amplification were performed. After the fragments were recovered, they were digested with Tsp45Ⅰ, and then the digested (digestion group) and non-digested templates (control group) received PCR amplification analysis. The non-coding RNA G/U expression of SNP rs6983267 in the two groups was detected by restriction endonuclease-PCR. pGL3-Gs-LUC (pGL3-Gs-LUC group), pGL3-Ts-LUC (pGL3-Ts-LUC group) and pGL3-Basic-LUC were respectively transfected into KM12C and KM12SM cells. The non-coding RNAs of transcriptional activity in KM12C and KM12SM cells were detected by the dual luciferase reporter gene analysis.Results The ENCODE database showed that non-coding genes existed near the SNP rs6983267 locus in the 8q24 region on chromosome. In the KM12C cells, the non-coding RNA G/U ratios of the SNP rs6983267 in the digestion group and control group were 0.71±0.09 and 1.43±0.11, and the ratios were 0.80±0.10 and 5.60±1.30 in the KM12SM cells. Compared with the control group, the non-coding RNA G/U ratio decreased in the KM12C cells and increased in the KM12SM cells (allP<0.05). In KM12C cells, the relative expression activity of the G promoter and T promoter on the rs6983267 locus was 0.81±0.14 in the pGL3-Gs-LUC group, and 0.82±0.25 in the pGL3-Ts-LUC group, and in the KM12SM cells they were 1.00±0.26 and 1.85±0.58, respectively. In KM12SM cells, statistically significant difference was found between these two groups (P<0.05), while in the KM12C cells, no statistically significant difference was found (P>0.05).Conclusion The G/U ratio of SNP rs6983267-related non-coding RNA may be associated with colon cancer metastasis.

colonic neoplasms; neoplasm metastasis; single nucleotide polymorphism; rs6983267; non-coding gene

国家自然科学基金资助项目(31050010)；教育部留学回国人员科研启动基金(教外司留[2015]311号)；河北省人社厅归国留

学基金择优资助项目(C201400358)。

蔡文臣(1991-)，女，硕士研究生在读，主要研究方向为肿瘤分子生物学。E-mail：1534760498@qq.com

郭志义(1971-)，男，副教授，主要研究方向为肿瘤分子生物学。E-mail：guozhiyiguo@yahoo.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.45.003

R735.35

A

1002-266X(2016)45-0009-03

2016-03-24)